“黑船来航”事件，迫使日本开国，却引爆了日本社会的各种矛盾，延绵260年的德川幕府统治走向末路。在以倒幕为目标的“尊王攘夷”运动中，自12世纪以来被排除在权力之外的天皇朝廷重新掌握政权，通过明治维新，使日本走上资本主义发展道路。在新生力量与旧制度血雨腥风的对决中，很多时代精英被裹挟到时代洪流中，以血肉和生命，为新日本的诞生祭旗。

安政五年（1858）春，几乎与“松下村塾”增建改筑的同时，彦根藩藩主井伊直弼出任幕府大老（江户时代幕府官职，相当于内阁总理大臣）。六月起，在尚未得到京都朝廷敕许的情况下，先后与美、俄、英、法、荷缔结了不平等条约。日本民族危机激化，国内舆论沸腾，以水户、越前、尾张和一桥为代表的诸家纷纷把批判矛头转向幕府实权人物间部诠胜。受到风起云涌的形势的激发，吉田松阴的言论和行动趋于过激起来，极力主张首先解决间部诠胜。一般认为这是因为吉田当时年轻气盛，思想冒进所致。但也有研究表明，这里面也有吉田松阴深思熟虑的考量：他在松下村塾执教四年，一方面感觉自身现状已经难以实现抱负，于是将挽救日本危亡的希望寄托在“松下村塾”门下杰出的弟子们身上；另一方面，追随松阴的弟子们，虽然在导师的言传身教下迅速励志成长，但还不够成熟，最主要是缺乏到时代洪流中摸爬滚打的机会，缺少将理想付诸实践的勇气。因此决定以身作则，践行理想信念。

与此同时，吉田松阴准备策划暗杀间部诠胜。但是刺杀计划由于弟子久坂玄瑞、高杉晋作、桂小五郎等人的反对而取消。从此吉田松阴更坚定了幕府才是日本发展的最大障碍，要挽救日本于危亡首先要有发动倒幕运动这样一个思想认识。长州藩藩主担心吉田师徒闹出大事，再次将他拘捕。

为了挽回幕府摇摇欲坠的权威，安政六年（1859）三月，幕府大老井伊直弼一举发动“安政大狱”，以铁血手段对付挑战幕府权威的人士，大肆逮捕倒幕维新志士。五月，幕府命长州藩毛利氏将松阴押解到江户。吉田松阴知道，幕府千里指名要人，一定凶多吉少，临行给弟子们遗言：

战士应得正而毙，何必明哲保身。不能见机而作，犹当杀身成仁。道并行不悖，百世以待后人。(www.daowen.com)

六月中旬抵达江户，拘禁于小传马町牢狱，其后开始进行一系列审讯。

在接受幕府审讯时，松阴表现了一个革命家应有的视死如归的节操，他将佩里来航以来自己为国为民奔波的经历思想以及暗杀间部诠胜的计划和盘托出，并揽下所有责任。幕府闻之震动，在量罪定刑时，审判团判以“流放”之罪；但在二审时，井伊直弼大笔一挥将所有判处流放者一律改判“斩首”。同年10月27日上午，秋风瑟瑟中，吉田松阴被押往江户塚原斩首，年方29岁。在得知自己刑期的前一日，松阴写完了最后的遗著《留魂录》，并作《辞世诗》明志：

此身虽殉武藏野，枯骨犹唱大和魂。

吉田松阴服刑的次日，桂小五郎等同学作为死者家属前往刑场认领尸首。看到导师身首异处、血污淋漓的惨状，门徒们伏尸痛哭，发誓要继承导师的遗志，成为残暴腐朽旧制度的终结者，还要给日本带来正义、公平与尊严。他们将松阴首级遗体清洗干净后，用外衣包好，放入大瓮中安葬在江户一座小寺庙里。