有机磷农药是哺乳动物中毒作用的基础，通常与它们抑制中枢和周围神经系统的胆碱酯酶的能力有关。酶抑制法是利用有机磷农药的毒理特性建立的一种快速检验方法。由于有机磷农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使该酶分解乙酰胆碱的速度减慢或停止，再利用纸片或电极（即纸片法和膜电极法）作为载体将乙酰胆碱酯酶吸附在上面，如果酶的活性没有被抑制，生成了基质水解产物，使用呈色剂或发色的基质而显色。反之，如果被测样品中含有农药残留，则酶的活性被抑制，基质就不被水解，遇显色剂不显色。这样，通过纸片颜色的变化或电极的读数指示变化上可以测定有机磷农药与标准有机磷农药比较则可定量。AOAC在1964年最早公布了该方法检测有机磷农药，美国1958年就研制出了称之为酶片（En2yme Ticket）的商品来检测有机磷农药，灵敏度为0.1～10×10^-6。Sigma公司也有类似的检测试剂盒。国内李发生、朱曜分别报道了纸片法检测食品和出口冻牛肉中的有机磷农药，灵敏度为0.1～3.0×10^-6。国内也有生化公司正式生产和销售称之为农药速测卡的产品。Kulys F研制了胆碱酯酶电流传感器，Bernabei M用胆碱和乙酰胆碱电化学传感器检测有机磷农药，李发生也报道了利用酶传感器检测5种有机磷农药，最低检出浓度为1×10^-12mol/L。

酶抑制法最大的优点是操作简单、速度快，不需昂贵的仪器，特别适合现场检测以及大批样品的筛选，易于推广普及，但灵敏度比仪器法要差一些，重复性、回收率还有待提高。

胆碱脂酶能分解乙酰胆碱或其他酯类，而有机磷能抑制胆碱酯酶，使其失去分解活性，通过检查乙酰胆碱或其他脂类化合物的分解产物，便可判断样品中是否含有有机磷。根据对分解产物检测手段的不同，可分为酸碱指示剂法、速测卡法、分光光度计法、荧光法等。其中速测卡法和分光光度计法已被国家定为标准的分析方法。

1.速测卡法

农药速测卡是用对农药高度敏感的胆碱酯酶和显色剂做成的酶试纸，可以快速检测蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯的残留情况。本法抗干扰性强、操作简便，不需要仪器设备和配制试剂就能单独使用，无需任何专业技术培训。产品容易贮存、携带方便，是现场检测的最佳方法。

胆碱脂酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸910类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。将胆碱脂酶和靛酚乙酸酯试剂固化在纸片上，制成速测卡，检出限一般在0.3～3.5mg/kg。它具有操作简便、快速、经济等特点，适用于现场筛选，但有时试纸颜色判定不明显，易造成判断与实际不符合；另外，洗脱液（缓冲溶液）对蔬菜农药的提取率在50%～80%。使用速测卡进行测定时有两种使用方法：

（1）整体测定法

1）选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm²左右碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL纯净水或缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上。

2）取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。

3）将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。

4）每批测定应设一个纯净水或缓冲液的空白对照卡。

（2）表面测定法（粗筛法）

1）擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴洗脱液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。

2）取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。

3）放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min，预反应后的药片表面必须保持湿润。

4）将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。

5）每批测定应设一个洗脱液的空白对照卡。

结果判定：与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色均为阳性结果，不变蓝为强阳性结果，说明农药残留量较高，显浅蓝色为弱阳性结果，说明农药残留量相对较低。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。对阳性结果的样品，可用其他分析方法进一步确定具体农药的品种和含量。

2.分光光度计法（抑制率法）

在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以比尔-朗伯定律为基础。

近年来，紫外光及可见光分光光度分析已得到广泛的应用，它不仅可以用于物质的鉴定及结构分析，还可以用于某些物质含量的测定。

分光光谱技术可用于：①通过测定某种物质吸收或发射光谱来确定该物质的组成；②通过测量适当波长的信号强度来确定某种单独存在或与其他物质混合存在的一种物质的含量；③通过测量某一种底物消失或出现的量同时间的关系，追踪反应过程。

紫外及可见光分光光度法，这是一种只在可见光及紫外光光谱应用范围内测量物质吸收辐射线的技术，应用十分广泛。其中分光光度计可用于精确测量特定波长的吸收值，而比色计则是一种较简单的测量仪器，其原理是利用滤光片来测量较宽波段（如可见光中的绿光、红光或蓝光范围）的吸收值。

溶液对光的吸收有两个基本法则：①透过溶液的光的吸收值同吸收溶质的分子数目（即溶质浓度C）呈指数相关；②透过溶液的光的吸收值同透过吸收溶液的路径长度l成指数相关。这两条法则包括在比尔-朗伯关系式中。通常以入射光（I_o）和透射光（I）的吸光度来表示：

A=lg（I_o/I）=εcl(www.daowen.com)

式中，lg（I_o/I）称为吸光度，旧称光密度；ε为吸光系统或吸收系统；c为样品浓度，单位为mol/L或g/L；l为光程。吸收值常用下角表示其波长，如A₅₅₀表示550nm处的吸收值。透过溶液的光的比例称为透光率（T），可由出射光和入射光的比值求得。

比色计用于测定颜色明显，并且是溶液主要组分的待测物，如血液中的血红细胞，也可以在待测物中加入一种试剂，使其形成有色产物（一种生色团），如用茚三酮法测定氨基酸含量。定量分析某种物质要做标准曲线，标准曲线是在测定待测样品的同时测定已知含量的物质来制成的，而不是使用比尔-朗伯关系。

光源通常为钨丝灯泡，通过一个凸透镜聚焦后产生一束平行光，平行光穿过装有溶液的玻璃样品或小池，然后透过一个有色滤光片到达光电探测器，检测仪产生一个同落在光电探测器上的光密度成正比的电势，来自于光电探测器的信号被放大然后传递到电流计或数字读数器。

比色计的使用：①接通电源使仪器稳定，使用前至少要让灯预热5min；②选择一种同底物颜色互补的滤光器；③调零（用空白对照调零）；④调整灵敏度；⑤分析样品及标准溶液；⑥由于不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同，因此为了提高精确度，同一试验应用同一比色杯，且在比色槽中摆放的方位相同；⑦每次测样前清洗比色杯；⑧经常重复测定同一溶液检验比色计的可重复性；⑨用标准溶液绘制标准曲线。

由于大多数过滤器过滤出来的光的波带很宽，因而比色计既不能用于确定某种复合物，也无法分辨在混合液中吸收特性非常相近的两种物质。比色计所用光电探测器的变化系数为0.5%左右，因而不适合要求具有高度精确性的工作。使用这种最简单的仪器，由于仪表上对数测量刻度单位的随意性，即使是把表上的灵敏度/刻度调节到零控点，在一个仪器上获得的值不可直接同另一台仪器上测得的值相比较，同一仪器的不同设置之间也不可直接比较。比色计对于特定波长的量化工作是不合适的。

分光光度计之所以优于比色计就在于使用了一个衍射光栅将光源的复色光转换为单色平行光束。实际上从这种单色平行光束产生的光不是某个波长的光，而是一段窄的带宽上的光，带宽是分光光度计的一个重要特性，这是由于它决定了吸收测量中所用的波长。普通分光光度计的带宽为5～10nm，用于研究的仪器的带宽小是因为光栅夹缝的宽度影响着带宽，带宽随光栅夹缝宽度的减少而降低，要获得特定波长下的精确数据，尽可能使用最小的缝宽度。然而，减小缝宽也会减少到达监测器的光，降低了信噪比。缝宽可减小的程度取决于检测放大系统的灵敏度及稳定性。

大多数可见光分光光度计使用的比色杯的光穿过路径为10nm。一次性塑料杯适合于对水和乙醇溶液在可见光范围内的测量。玻璃比色杯的生产要求更加严格的标准，因而在精确研究中要使用玻璃比色杯，尤其当溶液的吸收值很低时（＜0.1），即使盛对照液与待测样品液的比色杯在光学性质上有稍许不同，也会导致结果偏差。玻璃和塑料会吸收紫外光，因此在测波长小于300nm的吸收值时要使用石英杯。

进行测量之前，比色杯要保证干净、无划痕、外表面干燥、盛液到适当高度，并放在比色槽的正确位置上。生物样品中的蛋白质和核酸可能会在玻璃、石英杯的内表面沉积，因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯内的沉淀，或用1mol/L硝酸浸泡过夜。腐蚀性及毒性溶液必须使用有盖子的比色杯，以防止溅出，破坏仪器。

基本分光光度计使用的光电探测器类似于比色计中所使用的光电探测器。许多情况下，当波长高于600nm和低于550nm时必须使用不同的光电探测器，这是因为它们在可见光波长内的灵敏度不同，更精准的仪器中所使用的是具有比光电探测器更高灵敏度和稳定性的检测器。数字显示由于不易产生视觉错误和误读范围的错误，正逐渐代替指针读数。一些仪器可以直接给出所测定物质的浓度。

基本分光光度计只产生单束光。这种仪器首先用空白对照调到零吸收值，然后取出空白液，加入待测液，测定待测液的吸收值。也有一种双束分光光度计，有单色光源产生的光束被分为两束，一束穿过待测液，另一束穿过空白液。吸收值由一个电子电路通过对比透过待测液及空白液的出射光进行测定。双光束分光光度计减少了由于光源输出的不稳定或检测系统灵敏度的变化而导致的测量错误，这是由于待测液与对照液是同时进行测量的。记录式分光光度计是一种双束测定仪，用于记录已知波段下吸收值随时间的变化（如用于酶分析）。

假如已知一种物质在某一波长下的吸光率（通常是该物质的最大吸收值，这时灵敏度最高），这种物质纯溶液的浓度可用比尔-朗伯关系式算出。摩尔吸光系数是指物质在1mol/L的浓度下，比色杯厚度为1cm时的吸收值。该值可以从光谱数据表中查到，也可以用实验方法通过测量一系列已知浓度的物质的吸收值来绘制一条标准曲线。这样，在所要求的浓度范围内，便可确定吸收值与浓度之间存在的线性关系，该直线的斜率即摩尔吸光系数。

比吸光率是指物质质量溶液浓度为10g/L时，比色杯厚度为1cm时测定的吸光值。该值对于未知分子质量的物质如蛋白质核酸的测定很有用，这种情况下溶液中物质的含量以其质量表示而不用摩尔浓度表示。使用公式lg（I_o/I）=εcl，比吸光率要除以10才可以得到一个以g/L为单位的浓度值。

正常情况下，酶催化乙酰胆碱水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质。在一定条件下，有机磷和氨基甲酸脂类农药对胆碱脂酶的活性有抑制作用，使水解过程受抑制，其抑制率与农药的浓度呈正相关。用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，当抑制率≥50%时，表示样品有有机磷或氨基甲酸酯类农药存在（丁酰胆碱酯酶的抑制率一般控制在70%以上为阳性样品）。对检出的阳性样品，可用其他方法进一步确定具体农药品种和含量。检出限一般在0.05～5.0mg/kg，检出时间为30min。该法以数字形式读取数据，较为直观，可避免目视法因显色不明显而判断不准。

3.速测灵法（金属离子催化显色表面皿法）

农药残留特别是高毒农药残留直接影响人体健康，长期食用含有残留农药的农产品，可导致人体胃肠道疾病、身体免疫力下降，出现慢性腹泻、恶心、经常性感冒、头晕、心悸、盗汗、失眠、健忘等症状。残留农药进入体内，主要依靠肝脏制造酶来吸收这些毒素，进行氧化分解。如果长期食用带有残留农药的食品，肝脏就会不停地工作来分解这些毒素，长时间的超负荷工作会引起肝硬化、肝积水等一些肝脏病变，残留农药中含有的化学物质还可促使人体组织细胞发生癌变。速测灵法（金属离子催化显色表面皿法）依据金属离子催化显色表面皿法研制而成。检测时，食品中的残留农药可迅速与本试剂发生水解反应，水解产物与显色剂反应，使显色剂的紫红色褪去。这种方法为化学试剂检测法，一次可同时检测5个样品，具有快速、简便、成本低等特点，避免了生化试剂需特定的保存和反应条件。

有机磷农药（磷酸酯、二硫代酸酯、磷酰胺）在金属离子催化作用下水解为磷酸与醇，水解产物与显色剂反应，使显色剂的紫红色褪去变成无色。就甲胺磷、对硫磷、敌敌畏而言，检测的灵敏度为0.18～10.0mg/kg。对阳性结果，基本可判定农药残留超标。该法避免了使用生化法（酶抑制法）受酶效价的影响，不需使用仪器，操作简便、快速、经济。局限性在于主要针对的是甲胺磷、对硫磷等农药残留定性。该方法适用于食用农产品，主要是叶菜类蔬菜、瓜果、豆类等中的残留高毒有机磷农药。

使用该方法进行检测时的检测步骤如下：①用吸管吸取1mL洗脱液，放入洗净的提取杯中，再加洁净水至20mL；②用吸管吸取提取杯中的洗脱液，反复冲洗待测样品正反页面各3次，静置片刻后，其上清液即样品液；③用吸光从提取杯中吸取1mL样品液，加入多孔比色管中，建议设对照孔并加等量清洁水（显色管加5mL，使溶液高度与多孔比色管相同）；④在上述多孔比色管中依次滴加1滴检测液A和检测液B，搅拌混匀后，静置片刻，观察样品颜色变化，并对照比较后判断。如果比色管中液体紫红色全部褪去，则表明农药残留超量，不能食用；若不变色或变色不显著，表明无农药残留，或不超量；多点抽样，重复测定，正确判断。必要时留样进一步以仪器法确证、定量。在进行测定时要注意以下6个问题：

1）取样时，注意样品的代表性，清洗要均匀到位。

2）检测时，检测液A、检测液B在多孔比色管的孔中或显色管中与样品液混合一定要搅拌混匀。

3）发现超标或有争议的检测结果，可进一步采用定量法检测。

4）每次使用多孔比色管等器皿后，需将孔内液体甩干，并用清水冲洗干净，晾干备用。

5）试剂有轻度腐蚀性，禁入口眼。

6）阴凉处避光密封保存，保存期12个月以上。