色谱法也称色层法或层析法，是一种物理化学分离分析方法。它是利用混合物各组分在两相间分配系数的差异，达到各组分分离的目的，并使分析物质的浓度转化为易被测量的电信号，然后用记录仪记录下来。目前应用于检测有机磷的色谱法主要有薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、超临界流体色谱法。

1.薄层色谱法

薄层色谱法是利用被检测物经显色后同标准有机磷农药比较来定性，用薄层扫描仪来定量的测定方法。它可同时分析多个样品，多用于复杂混合物的分离和筛选，具有成本低、可现场操作的特点。薄层色谱法如果和其他技术联用，可以得到更高的灵敏度和更广的测试范围。若与荧光显色技术结合，对有机磷的检测限为0.01_μg；与酶抑制技术结合，对有机磷的检测限可达0.001Pg。但是准确度不高、预处理繁琐，只适用于挥发性农药，适用范围窄，选择性和灵敏性不高。

薄层色谱法是一种成熟的、应用也较广的微量快速检测方法。它在农药残留测定技术上有它独特的用处，它既是重要的分离手段，又是定性、定量的分析方法。它的特点如下：

1）薄层上离析的理化过程，因不受物质的限定，故在方法的设计、拟定和实际应用上机动灵活，适合于对多种类型样品、多种农药检测。

2）薄层的分离能力强，效果明显，对复杂混合物的划分、不稳定物质的分离、相似化合物的离析和鉴定特别有用。

3）薄层色谱的显色反应类型多，显色剂范围广。同一种农药一般有数种显色方法，同一种显色剂有时适应多种或一大类农药的显色反应，而且薄层吸附剂一般不受腐蚀试剂的限制，可根据样品性状和检测要求选择使用。

4）薄层层析与仪器配合的联用（如扫描仪、光密度计等），则测定迅速、灵敏度高、重现性好、测试范围宽。

5）薄层色谱原位斑点面积直接定量法，无需特殊设备和试剂，方法简易、快速、直观。

检测过程一般先用适宜的溶剂提取有机磷农药，经纯化浓缩后，在薄层硅胶板上分离展开，显色后与标准的有机磷农药比较R_f值进行定性测定或用仪器进行定量测定。

2.气相色谱法

气相色谱法是目前最典型、应用最广的农药检测方法，也是检测有机磷的国家标准方法，检测限可达0.1ng，具有准确、灵敏度高的特点，并且一次可以测定多种成分。气相色谱法是农药残留检测中比较重要的方法。它具有分析速度快、分离效能高、分离和测试一次完成等优点，被许多国家作为农药残留分析的标准方法。随着毛细管柱的广泛应用，柱处理、检测器以及进样系统的不断优化，大大提高了气相色谱分析的精密度和灵敏度，拓宽了气相色谱在农药残留分析中的应用。

随着现代仪器分析方法的发展，气相色谱法已成为目前典型的，应用最广的仪器分析方法。农药测定技术的应用主要是从20世纪60年代开始的，可以这样认为，由于气相色谱的应用，特别是高灵敏度的选择性检测仪器的应用，农药残留量的测定水平提高到一个新的台阶。就在各种新的检测方法不断出现的今天，气相色谱法仍占绝对的优势，就是由过去以填充柱为主转为目前的以毛细管柱为主。由于石英毛细管柱的出现和进样系统的不断改进，大大提高了气相色谱法的分析精度、准确度和灵敏度，但气相色谱法对于挥发性差、极性和热不稳定性的农药分析较困难。AOAC对大部分有机磷农药（如乙拌磷、丰索磷、马拉硫磷、对硫磷）在80年代就建立了气相色谱检测方法。我国食品理化检验国家标准方法也采用了气相色谱检测有机磷农药。该方法是利用经提取、纯化、浓缩后的有机磷农药注入气相色谱柱，程序化升温汽化后，不同的有机磷农药在固相中分离，经不同的检测器检测扫描绘出气相色谱图，通过保留时间来定性，通过峰或峰面积与标准曲线对照来定量。一次可同时测定多组分，简便快捷、灵敏度高、准确性好。而色谱条件的最佳设定是气相色谱技术的关键。日本学者Omura M研究了7种不同极性的固定相来分离检测不同极性的有机磷农药，检出限达0.05～10ng。Marble L.K比较了萃取法和固相净化柱来纯化有机磷农药，认为0B-1B柱能获得最佳效果。而Manes J用C18柱反相柱从水中分离浓缩有机磷农药得到很好的回收率。其他研究还报道了用凝胶渗透色谱法净化谷物、饲料中的有机磷农药残留，检出限达0.01～0.05ng。近年来毛细管气相色谱（CGC）法得到了不断的发展和完善，使毛细管柱基本代替了原来的填充柱，不仅提高了灵敏度，分辨率和检测速度，而且稳定性，使用寿命都比填充柱优良。国外MiyabaraU和JonogaiY分别用电子俘获检测和火焰光度检测的毛细管气相色谱法测定了食品中几十种有机磷农药。而在国内，杨大进等报道了可同时测定大米中20种有机磷农药和6中氨基甲酸酯农药残留的毛细管气相色谱方法。余新建等采用HPl701毛细管柱分离测定柑橘中7种有机磷农药残留量，比较了7种有机磷农药在柑橘不同生长时期的残留量情况，7种有机磷农药的回收率为83.5%～106.4%，RSD=3.0%～7.8%，检出限为0.1～20Pg/kg。另外陈泉、楼小华等也用毛细管气相色谱法分别检测了13种、25种样品中不同的有机磷农药，回收率和重复性都很好。(www.daowen.com)

目前，随着气相色谱仪的普及，对可能存在有机磷农药残留的样品（如食品、果蔬、谷物、饲料、茶叶、水产品、土壤、植物材料、水体、以及血液、化妆品、羊毛脂、牛奶）都建立了气相色谱检测方法。

3.高效液相色谱法

高效液相色谱法是一种以流体为流动相的高效、快速的分离技术，与气相色谱法相比，具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点，不需要汽化，不受试样挥发性的限制。但是高效液相色谱法要配备昂贵的检测仪器，试剂消耗也比较大，主要用于检测一些不适于用气相色谱法检测的少数农药。

高效液相色谱法是在液相色谱柱层析的基础上，引入气相色谱理论并加以改进而发展起来的色谱分析方法。高效液相色谱法在农药残留分析领域的应用越来越广泛，是因为高效液相色谱法能适合分析沸点高而不太容易汽化、热不稳定和强极性农药及其代谢产物，且可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱等联用，易实现分析自动化，同时一些新型检测器的问世在一定程度上提高了高效液相色谱法的检测灵敏度。与气相色谱法相比，不仅分离效能好、灵敏度高、检测速度快，而且应用面广。AOAC中有近半数的有机磷农药都建立了高效液相色谱法，研究报道也很多，Branca P、Sharp G.J和Brayan J.G用高效液相色谱法分别测定了食品和水中、谷物及其制品、水稻中的有机磷农药。Martindale R.W比较了高效液相色谱法和气相色谱法测定马铃薯中的有机磷农药。不断改进的高效液相色谱法技术也扩大了高效液相色谱法检测有机磷农药的应用范围。Mailet V N用7种不同的萃取方法提取环境中的有机磷农药，并用高效液相色谱法来检测。Carabias R.采用紫外高效液相色谱法来检测水果中的有机磷农药。在国内，包宏等采用高效液相色谱法对西红柿中克线磷残留量进行检测，样品用等量无水Na₂SO₄吸收水分后，用含1%磷酸丙酮对样品进行提取，用CH₂Cl₂在样品酸性和碱性溶液中分别进行萃取，以达到净化目的。采用ODS柱，以甲醇—水（30∶70）为流动相，测定波长为250nm，方法最低检出量lng，回收率为83.9%～91.4%，RSD为2.26%～4.37%。

4.超临界流体色谱

超临界流体色谱是20世纪80年代的技术，以超临界流体为流动相，综合利用了气相色谱和一些色谱的优点，由于超临界流体具有气体和液体的双重性质，其黏度小、传质阻力小、扩散速度快，其分离能力和速度可与气相色谱相比。超临界流体色谱还可与气相和液相的检测器相匹配，可与红外光、紫外光、质谱联用，成为一种强有力的分离和检测手段。

超临界流体是物质在高于临界压力和临界温度时的一种状态，它具有气体和液体的某些特殊性质，具有气体的低黏度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特征。SFC是GC和LC的补充，SFC可以解决气液色谱分析中的难题，它可以分析气相色谱难气化的不挥发性样品，同时具有比高效液相色谱更高的效率，分析时间更短，因而可以方便地进行定性、定量分析。在众多分析领域已有愈来愈多的应用。

图4-1 纯物质的相图

对于某些纯物质来说，具有三相点和临界点，如图4-1所示，从图中可以看出，物质在三相点，气、液、固三态处于平衡状态，当处于临界温度和临界压力以上时，则不论施加多大压力，气体也不会液化，此时既非气体，也非液体，而是以超临界流体形式存在。

超临界流体色谱兼有气相色谱和液相色谱的特点。它可分析气相色谱不适应的高沸点、低挥发性样品，且比高效液相色谱有更快的分析速度和条件。操作温度主要取决于所选用的流体，常用的有二氧化碳及氧化亚氮。超临界流体容易控制和调节，在进入检测器前可以转化为气体、液体或保持其超临界流体状态，因此可与现有的任何液相或气相检测器相连接，能与多种类型检测器相匹配，扩大了它的应用范围和分类能力，在定性、定量方面有较大的选择范围。还可以用多种梯度技术来优化色谱条件，并且比高效液相色谱法易达到更高的柱效率。