运用酯酶活性法确定藻类细胞裂解速率需要测定3个参数[5]:颗粒态酯酶活性(particulate esterase activity,PEA)、水中溶解性酯酶活性(dissolved esterase activity,DEA)、溶解态酯酶的衰变周期(T1/2)。
1.2.1 PEA和DEA的测定
取100~250 mL水样过滤到滤膜上,用0.1 mol/L磷酸缓冲液(p H=7.8)研磨,离心后取上清液4 mL,与950μL 0.1 mol/L磷酸缓冲液和50μL 2.5 mmol/L FDA混合,使得FDA终浓度为25μmol/L。黑暗处30℃培养1 h后进行测定。FDA在酯酶作用下裂解,其裂解产物能够定量地发出荧光。使用荧光光度计测定,激发波长490 nm,发射波长520 nm。使用荧光素做标准曲线,酯酶活性的单位为nmol FDA/(L·h)。DEA测定取过滤后水样(4 mL),具体方法与PEA相同。
酯酶衰变常数的测定为取0.2 μm(Millipore)滤膜过滤后的水样加入250μL稀释1 000倍的猪肝酯酶,在室温条件下于黑暗处培养1周,每天取水样测定溶解性酯酶活性。
1.2.2 细胞裂解速率的测定
细胞裂解速率通过颗粒态酯酶活性相对于时间的变化来计算:
式中 μL——细胞裂解速率;
PEA0——初始状态颗粒态酯酶活性;
PEAt——经过t时间后颗粒态酯酶活性,(www.daowen.com)
等于PEA0减去这段时间间隔中产生的溶解性酯酶EAprod。
溶解性酯酶的衰变常数(μ(loss)EA)计算公式为:
式中 EA0——加入猪肝酯酶后初始状态水中溶解性酯酶活性;
EAt——加入猪肝酯酶t时间后水中溶解性酯酶活性。
酯酶的衰变周期为:
EAprod为每小时产生的溶解性酯酶:
式中 EA——初始时水中溶解性酯酶活性[nmolFDA/(L·h)]。
由此,浮游植物细胞裂解速率计算公式为:
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