运用建立微流控芯片平台，以细胞ROS为指标研究烟气暴露下细胞的氧化应激作用。

实验以ROS作为氧化应激指标，以A549细胞作为细胞模型，研究烟气暴露下细胞的氧化应激作用，所用烟气暴露装置及烟气收集方法皆同前所述。

如前所述，烟气暴露下细胞毒性检测，随着流速及暴露时间的增加，细胞死亡率增加，并发生细胞凋亡。烟气暴露下，细胞ROS增加，发生氧化应激反应，诱导细胞死亡。为研究烟气暴露之后，细胞中ROS变化，使用ROS荧光探针DHE（二氢乙啶）对细胞进行染色，使用绿光激发得红色荧光，荧光强度的大小与细胞内ROS的量呈正相关，据此判断细胞ROS变化。①研究细胞ROS与烟气流速的关系。两芯片进气口都连接烟气，控制烟气暴露时间20min，分别调节流速为0，4，8，12，20mL/min，实验后染色观察。②研究细胞ROS与暴露时间的关系。两芯片进气口都连接烟气，控制流速4mL/min，分别调节时间为0，20，40，60min，实验后染色观察。③芯片烟气梯度下细胞ROS检测。在一片芯片上，一边连接烟气，另一边连接空气，调节流速为4mL/min、暴露时间为20min，实验后染色观察。

研究卷烟烟气细胞ROS与烟气暴露剂量的关系，两芯片进气口都连接烟气，固定烟气暴露时间20min，以不同的烟气流速暴露于A549细胞即0，4，8，12和20mL/min。细胞烟气暴露之后，使用DHE荧光染料对细胞染色，荧光倒置显微镜下，绿光激发细胞发出红色荧光，荧光强度越强，细胞ROS浓度越大，使用Image J软件对细胞荧光强度进行分析。

如图5.35所示，细胞烟气暴露之后，DHE荧光染色，得图5.35（1），使用软件分析荧光强度较强的细胞所占百分比，统计数据如图5.35（2）所示。由图可看出，细胞本身所含ROS很少，烟气暴露后，细胞中ROS明显增加；随着流速增加细胞ROS趋于稳定。

图5.35 细胞ROS与烟气流速的关系图

研究卷烟烟气细胞ROS与烟气暴露剂量的关系，两芯片进气口都连接烟气，固定烟气流速4mL/min，以不同的暴露时间暴露于A549细胞即0、20、40和60min。细胞烟气暴露之后，使用DHE荧光染料对细胞染色，荧光倒置显微镜下，绿光激发细胞发出红色荧光，荧光强度越强，细胞ROS浓度越大，使用Image J软件对细胞荧光强度进行分析。(www.daowen.com)

如图5.36所示，细胞烟气暴露之后，DHE荧光染色，得图5.36（1），使用软件分析荧光强度较强的细胞所占百分比，统计数据如图5.36（2）所示。由图可看出，结果与上面相同，烟气暴露后，细胞中ROS明显增加；随着烟气暴露时间增加细胞ROS趋于稳定。

图5.36 细胞ROS与暴露时间的关系图

由上面研究流速及暴露时间与细胞ROS的关系，了解到随着烟气流速和暴露时间的不断增加，细胞ROS没有变化；因此为在一片芯片上实现细胞ROS的梯度变化，研究使用流速为4mL/min、暴露时间为20min条件下，进行细胞ROS梯度检测。

如图5.37所示，细胞烟气暴露之后，DHE荧光染色，得图5.37（1），使用软件分析荧光强度较强的细胞所占百分比，统计数据如图5.37（2）所示。控制条件为20min和4mL/min，两个进气口，一边通烟气、一边通空气，对芯片上细胞进行烟气暴露，染色观察。由图可看出，在芯片上细胞荧光强度有一定的梯度变化趋势，随着烟气浓度的逐渐增加，细胞中ROS的量逐渐增加。在正常细胞中，ROS量很少，如图中5.37（1）所示，按实验统计方法，在大量的细胞中荧光强度较强的细胞所占百分比小于7%；在33%烟气刺激下，这个数量增加到12%，直至100%烟气下的36%。将其与上章节在流速为4mL/min、暴露时间为20min条件下，细胞存活率保持在95%相比较。虽然烟气暴露下细胞没有死亡，但是ROS已经明显的增加。说明细胞死亡是一个过程，细胞已经开始发生损伤，证实ROS在细胞凋亡中起着一定作用。

图5.37 烟气暴露下细胞ROS梯度变化