运用建立的微流控芯片平台，对凝胶气液界面上肺腺癌细胞A549进行烟气暴露，研究细胞毒性。

细胞毒性检测，分别进行烟气暴露下细胞毒性检测和液相暴露下细胞毒性检测，其中液相以H₂O₂作为刺激源。研究细胞毒性，使用AO-EB（吖啶橙-溴化乙啶）对细胞染色，在荧光倒置显微镜下观察，使用蓝光激发，活细胞呈绿色荧光、死细胞呈红色荧光，统计细胞存活率。

烟气暴露下细胞毒性检测，按上述所言，在芯片上装载好细胞，液体管道中通入细胞培养液。将收集好新鲜烟气的烟气袋和空气袋分别与上层芯片两个进气口相连接，控制条件，进行实验，然后使用AO-EB（吖啶橙-溴化乙啶）染色荧光倒置显微镜观察细胞活性情况。

液相暴露下细胞毒性检测，在芯片上装载好细胞，分别将含有H₂O₂的细胞培养液与纯净细胞培养液与下层芯片两个进液口相连接，控制条件，进行实验，然后使用AO-EB（吖啶橙-溴化乙啶）染色荧光倒置显微镜观察细胞活性情况。

烟气收集，使用单通道吸烟机以ISO抽吸模式收集烟气，抽吸参数：抽吸容量35mL、每口抽吸2s、每60s抽吸一口。烟气收集袋容量500mL。具体过程，首先将烟气袋中空气抽尽，然后使用吸烟机按照以上抽吸方法将烟气袋收集满烟气，最后将烟气袋连接上层芯片烟气进气口。

实验暴露所使用的结构图及暴露装置如图5.28所示。

如图5.28所示，（1）部分为芯片主体，三层芯片结构依次贴合；（2）部分为液体注射泵，调节流速分别通入不同液体；（3）部分为气体收集袋，将新鲜烟气收集到烟气袋中以通入芯片；（4）部分为真空发生器和气体流量计，真空发生器可以提供一个负压，气体流量计对流速进行调节。

凝胶，使用低熔点琼脂糖凝胶，凝胶的生物相容性、渗透性、透明性使其能够为细胞生长提供良好的环境，适用于细胞培养。低熔点琼脂糖，在常温下呈现固态，在温度为70℃时呈现液态，因此在这里可以很好的作为细胞载体，即将液态凝胶点加在孔中，在表面张力的作用下可以安放于孔中，再放于4℃冰箱中5min，这时凝胶固化，经前面所述证实它的渗透性和机械稳定性良好，可以作为细胞载体，用于构建凝胶气液界面。

图5.28 芯片结构图与暴露装置

1—气液双重梯度芯片；2—液体注射泵；3—气体收集袋；4—真空发生器及气体流量计

A549细胞、肺腺癌细胞、人肺泡Ⅱ型上皮细胞，是呼吸系统靶器官来源的主要细胞，被广泛应用于吸入毒性和呼吸系统疾病的体外细胞模型研究。因此，选用A549细胞研究卷烟烟气细胞毒性和氧化应激损伤。

（1）表征方法 实验使用卷烟烟气，进行烟气梯度表征，以确定烟气这种气溶胶在芯片上梯度分布。

具体过程：①使用PBS配制的浓度为2%低熔点琼脂糖凝胶（m/v），使溶解呈液态。②使用移液枪，在每个孔中点加0.7μL凝胶，放置4℃冰箱中5min，待凝胶固化。③按前述烟气收集方式，收集烟气。④将芯片贴合，以4mL/min的流速、20min暴露时间，于两个进气口，一边通烟气、一边通空气。⑤实验结束后，使用扫描电子显微镜，对每横列凝胶孔阵列附近处进行拍照分析。⑥使用Image J软件统计颗粒分布。实验以每横列孔附近处颗粒分布，推断确定凝胶上气体颗粒沉积情况，以分析通道中烟气梯度变化。

（2）结果分析 如图5.29所示，图5.29（1）是得到的芯片上烟气颗粒分布梯度变化SEM图，使用Image J软件对各通道颗粒分布统计分析，作得图5.29（2）颗粒分布图。如图所示，使用烟气作为暴露气体，可以在芯片上形成梯度。烟气颗粒大部分在1μm以下，与实际情况相符。这进一步证实该芯片平台可用于烟气刺激细胞实验研究。

图5.29 上层芯片烟气梯度表征

考察烟气暴露下，细胞毒性情况，①研究细胞存活率与流速的关系。两芯片进气口都连接烟气，控制烟气暴露时间20min，分别调节流速为0，4，8，12，20mL/min，实验后染色观察。②研究细胞存活率与暴露时间的关系。两芯片进气口都连接烟气，控制流速4mL/min，分别调节时间为0，20，40，60min，实验后染色观察。③芯片烟气梯度下细胞存活率检测。在一片芯片上，一边连接烟气，另一边连接空气，调节流速为20mL/min、暴露时间为20min，实验后染色观察。

（1）细胞存活率与烟气流速的关系 研究卷烟烟气细胞毒性与烟气暴露剂量的关系，两芯片进气口都连接烟气，固定烟气暴露时间20min，以不同的烟气流速暴露A549细胞即0，4，8，12和20mL/min。细胞烟气暴露之后，使用AO-EB荧光染料对细胞染色，荧光倒置显微镜下，蓝光激发活细胞发出绿色荧光、死细胞发出红色荧光，由此可检测细胞存活率。

如图5.30所示，图5.30（1）为不同流速下烟气暴露细胞AO-EB染色荧光图，对细胞存活率统计，得到变化趋势图（2）。由图5.30（2）可看出，在流速为0mL/min和4mL/min时，细胞几乎没有损伤，存活率≥95%；在流速为8mL/min时，细胞存活率还保持在90%；在流速为12mL/min时，细胞稍微有点损伤，但存活率还保持在80%左右，而当流速为20mL/min时，细胞存活率降到60%。为说明是否是由气体流速造成的细胞损伤，以20mL/min的流速，进气口通入空气20min，作为对照组，细胞无明显损伤，说明细胞损伤的确是由烟气造成。红色荧光细胞的增加说明，随着烟气流速的增加细胞死亡率增加；同时随着流速的提高，细胞中黄色亮度增强，这是细胞核染色质浓缩的结果，是细胞早期凋亡的特征，说明烟气与细胞的凋亡情况有一定的相关性。

图5.30 细胞存活率与烟气流速的关系图(www.daowen.com)

（2）细胞存活率与暴露时间的关系 研究卷烟烟气细胞毒性与烟气暴露剂量的关系，考虑上面细胞存活率与烟气流速的关系，在流速为4mL/min时，细胞几乎没有损伤，存活率≥95%，研究在此流速下，增加暴露时间，细胞存活率变化。两芯片进气口都连接烟气，固定烟气流速4mL/min，以不同的烟气暴露时间刺激A549细胞即0，20，40和60min。细胞烟气暴露之后，使用AO-EB荧光染料对细胞染色，荧光倒置显微镜下，蓝光激发活细胞发出绿色荧光、死细胞发出红色荧光，由此可检测细胞存活率。

如图5.31所示，图5.31（1）为不同暴露时间下烟气暴露细胞AO-EB染色荧光图，对细胞存活率统计，得到变化趋势图5.31（2）。由5.31（2）可看出，在暴露时间为0min和20min时，细胞几乎没有损伤，存活率≥95%；暴露时间增加到40min时，细胞存活率大幅度下降，细胞损伤变化明显，存活率为75%左右；当暴露时间进一步增加到60min时，细胞存活率降到60%。而以通入空气60min，细胞无明显损伤，说明细胞损伤的确是由烟气造成。红色荧光细胞的增加，说明随着烟气流速的增加细胞死亡率增加；同时在40min之后，黄色亮度明显增强，充分说明细胞凋亡的存在，这是细胞程序化死亡的一种形式，其与各种炎症与癌症的发生有很大的关系。

（3）芯片烟气梯度下细胞存活率检测 由上面研究流速及暴露时间与细胞存活率的关系，了解到随着烟气流速和暴露时间的不断增加，细胞存活率呈下降趋势；综合考虑为在一片芯片上实现细胞存活率的梯度变化，研究使用流速为20mL/min、暴露时间为20min的条件在一片芯片上进行烟气梯度暴露；因为如果暴露时间过长容易引入其他因素，带来不确定性，且操作时间过长；则在此时间条件下，为形成细胞存活率的梯度变化实验选择20mL/min这一流速，具体如下所述。

图5.31 细胞存活率与暴露时间的关系图

以流速为20mL/min、暴露时间为20min的条件在一片芯片上进行烟气梯度暴露，上层芯片一边进气口连接收集的新鲜烟气，一边进气口连接空气，以上述暴露条件进行烟气刺激，使用AO-EB荧光染料对细胞染色，荧光倒置显微镜下，蓝光激发活细胞发出绿色荧光、死细胞发出红色荧光，由此可检测细胞存活率。

如图5.32所示，图5.32（1）为同芯片上不同烟气浓度刺激下细胞AO-EB染色荧光图，对细胞存活率统计，得到变化趋势图5.32（2）。图5.32（2）横坐标1为接近空气一侧，4为接近烟气一侧，则1、2、3、4所表示的烟气浓度分别为0%、33%、66%和100%；由图可看出，在接近空气一侧，此通道为0%烟气，细胞几乎没有损伤，存活率≥95%；而接近烟气一侧细胞存活率为65%左右，此通道为100%烟气；在两者之间的通道分别为33%和66%烟气，细胞存活率也在两者之间变化。实验表明，在此暴露条件下，细胞存活率在芯片上随烟气浓度的增加呈剂量-效应关系。

图5.32 烟气暴露下细胞毒性检测

考察H₂O₂刺激下，细胞毒性情况。①研究细胞存活率与H₂O₂浓度的关系。两芯片进液口都通入H₂O₂细胞培养液，控制刺激时间2h，分别调节H₂O₂浓度为0、0.025、0.05、0.10mol/L，实验后染色观察。②研究细胞存活率与刺激时间的关系。两芯片进液口都通入H₂O₂细胞培养液，控制H₂O₂浓度0.025mol/L，分别调节刺激时间为0、1、2、3h，实验后染色观察。③芯片H₂O₂梯度下细胞存活率检测。在一片芯片上，一边通入0.05mol/L H₂O₂细胞培养液，另一边通入纯细胞培养液，调节液体流速为5μL/min、刺激时间为2h，实验后染色观察。

（1）细胞存活率与H₂O₂浓度的关系 研究H₂O₂刺激下细胞毒性与H₂O₂浓度的关系，两芯片进液口都通入H₂O₂细胞培养液，固定刺激时间2h，以不同浓度的H₂O₂刺激A549细胞即0、0.025、0.05和0.1mol/L，两个进液口均以液体流速为5μL/min通入一定浓度的H₂O₂培养液。细胞H₂O₂刺激之后，使用AO-EB荧光染料对细胞染色，荧光倒置显微镜下，蓝光激发活细胞发出绿色荧光、死细胞发出红色荧光，可检测细胞存活率。

如图5.33所示，图5.33（1）为不同浓度的H₂O₂刺激细胞AO-EB染色后细胞存活率统计图。由图可看出，在H₂O₂浓度为0mol/L和0.025mol/L时，细胞损伤不大，存活率≥90%；在H₂O₂浓度为0.05mol/L时，细胞存活率降到70%；在H₂O₂浓度为0.1mol/L时，细胞大部分都已死亡，存活率在20%以下。实验表明，随着H₂O₂浓度的增加，细胞死亡率增加，当浓度持续增加时，对细胞毒性更加明显。

（2）细胞存活率与刺激时间的关系 研究H₂O₂刺激下细胞毒性与刺激时间的关系，考虑上面细胞存活率与H₂O₂浓度的关系，在H₂O₂浓度为0.025mol/L时，细胞损伤不大，存活率≥90%，研究在此浓度下，增加刺激时间，细胞存活率变化。两芯片进液口都通入H₂O₂细胞培养液，固定H₂O₂浓度0.025mol/L，以不同时间刺激A549细胞即0、1、2和3h，两个进液口均以液体流速为5μL/min通入0.025mol/L H₂O₂培养液。细胞H₂O₂刺激之后，使用AO-EB荧光染料对细胞染色，荧光倒置显微镜下，蓝光激发活细胞发出绿色荧光、死细胞发出红色荧光，检测细胞存活率。

如图5.33所示，图5.33（1）为不同时间刺激细胞AO-EB染色后细胞存活率统计图。由图可看出，在时间为0、1和2h时，细胞损伤不大，存活率≥90%；在时间为3h时，细胞大部分都已死亡，存活率在40%。实验表明，随着刺激时间的增加，细胞死亡率增加，当时间持续增加时，对细胞毒性更加明显。

图5.33 H₂O₂刺激下细胞存活率统计分析（AO/EB荧光染色，蓝光激发）

（3）芯片H₂O₂梯度下细胞存活率检测 由上面研究H₂O₂浓度及刺激时间与细胞存活率的关系，了解到随着H₂O₂浓度和刺激时间的不断增加，细胞存活率呈下降趋势；综合考虑为在一片芯片上实现细胞存活率的梯度变化，研究使用H₂O₂浓度为0.05mol/L、刺激时间为2h的条件在一片芯片上进行H₂O₂梯度暴露；因为如果H₂O₂浓度过大易对细胞造成损伤；则在此浓度条件下，为形成细胞存活率的梯度变化选择2h刺激时间，具体如下所述。

两个进液口均以液体流速为5μL/min，一个进液口通入含有0.05mol/L H₂O₂的细胞培养液，另一个进液口通入纯细胞培养液，对A549细胞进行染毒，使用AO-EB荧光染料对细胞染色，荧光倒置显微镜下，蓝光激发活细胞发出绿色荧光、死细胞发出红色荧光，检测细胞存活率。

如图5.34所示，图5.34（1）为同芯片上不同H₂O₂浓度刺激下细胞AO-EB染色荧光图，对细胞存活率统计，得到变化趋势图5.34（2）。图5.34（2）横坐标1为接近细胞培养液一侧，4为接近H₂O₂一侧，则1、2、3、4所表示的H₂O₂浓度分别为0、0.017、0.033和0.05mol/L；可看出，在接近细胞培养液一侧，此通道H₂O₂浓度0，细胞几乎没有损伤，存活率≥95%；接近H₂O₂一侧细胞存活率为70%，此通道为0.05mol/L H₂O₂；在两者之间的通道，H₂O₂浓度分别为0.017mol/L和0.033mol/L，细胞存活率也在两者之间变化。实验表明，在此刺激条件下，细胞存活率在芯片上随H₂O₂浓度增加呈剂量效应关系。

图5.34 H₂O₂浓度梯度刺激下细胞毒性检测