中间层芯片为4×4阵列的孔状结构，根据实验所用材料、打孔方式、制作方法的不同，实验设计了以上三种方案（图5.15）。

图5.15 中间层芯片3种实验方案

方案A的实验过程：在一片洁净的玻璃片表面浇上未固化的聚二甲基硅氧烷（PDMS前聚体∶固化剂=10∶1），抽真空除气泡，在加热台上于70℃加热固化45min。揭下，得到一片PDMS薄膜。使用打孔器手动打孔4 × 4阵列，即得到中间层芯片。这种方案有优点也有缺点，优点：P DMS薄膜可重复使用，且易于上下层贴合；缺点：P DMS薄膜很薄、容易破损，同时手动打孔较麻烦，容易造成孔大小及排列不均一，最重要的是这种情况下在孔上点加凝胶，凝胶易脱落。

方案B的实验过程：按照上述上层芯片模板制作方法，在玻璃上制作阵列柱模板，将未固化的聚二甲基硅氧烷浇在这个模板表面，再使用另一片玻璃在上方贴合，用夹子夹紧，在加热台上于70℃加热固化45min。将玻璃、P DMS依次揭下，即得到P DMS孔阵列薄膜。优点：P DMS薄膜可重复使用，且易于上下层贴合，孔大小及排列整齐均一；缺点：P DMS薄膜很薄、容易破损，不能够保证所有的孔都上下互通，这种情况下点加凝胶，凝胶易脱落。

方案C的实验过程：直接使用激光雕刻机对P MMA板按照设计的4 × 4孔阵列结构进行雕刻，即得到孔阵列芯片。优点：实验操作方便简单，孔大小及排列整齐均一，最重要的是这种情况下点加凝胶，凝胶不易脱落，原因是激光雕刻时对板上下表面的作用略有差异，使得孔的下面圆直径比上面圆直径稍小，可以起到支撑的作用；缺点：P MMA板不宜重复使用，略有消耗。

综上所述，中间层芯片应采用实验方案C。采用这种方法装载凝胶时，不单单可以依靠凝胶在孔上的表面张力，还可以外在地为凝胶装载提供支撑。制作的芯片经紫外杀菌处理后即可用于细胞装载。

细胞装载方式：①细胞与低熔点琼脂糖凝胶混合后填充；②先填充凝胶，后填充细胞。具体情况如图5.16所示。

图5.16 中间层芯片细胞装载方式

如图5.16（1）的装载方式，当凝胶与细胞混合填充时，凝胶固化，细胞不在同一焦面上，这为后续在显微镜下聚焦观察带来不便，同时这种情况下细胞不能够与烟气直接接触。而图5.16（2）的装载方式，先将凝胶填充到孔中，固化后再将细胞填放在凝胶表面，细胞呈单层分布，且可与烟气直接接触。因此，实验采用第二种细胞装载方式。

芯片阵列结构图如图5.17所示，图5.17（1）为4×4的凝胶孔阵列，将细胞点加在凝胶表面，细胞会很快分散开来，呈单层分布，如图5.17（2）所示。

图5.17 中间层芯片孔阵列结构

在芯片上能够进行可靠的流体控制，是芯片上进行细胞生物评估实验的关键因素。本实验中选用凝胶构建气液界面。凝胶是一种半渗透性的物质，它不但能够为细胞培养提供机械支撑，同时能够渗入营养物质，为细胞提供良好的生长环境。本研究对构建的凝胶气液界面进行了相关表征。

（1）实验过程 为了验证，在液体连续流动的情况下，该界面是否能够承受液体流动压力，以保证细胞能够在界面上进行正常培养和生物评估，实验对凝胶稳定性进行检测。实验内容：①在凝胶中加入蓝色染料得蓝色凝胶，使用移液枪点加0.7μL于阵列孔中；②放置4℃冰箱中5min，待凝胶固化；③使用黄色染料为液体流动相，分别在不同流速下（10～500μL/min）连续流动。

图5.18 不同流速下，凝胶界面机械稳定性（0～500μL/min）

（2）结果分析 如图5.18所示为不同流速下（10～500μL/min），凝胶机械稳定性情况。当流速为0μL/min时，凝胶中的蓝色染料只会和液体中的黄色染料在静态下相互扩散，形成一个绿色的圆环。而当液体流动时，这个圆环就会发生变化，这是由静态扩散和液体层流共同作用的结果，形成一个三角形状。这个颜色图形的变化能够很好的反映出液体的流速。而在实验的过程中，没有发生液体渗出或凝胶掉落的现象。这充分说明凝胶气液界面能够满足后续使用。

（1）表征方法 为了验证凝胶与液体流动相快速交换的能力。实验使用溴百里酚蓝这种酸碱指示剂进行表征。在pH＞7.6时，其是蓝色；7.6＞pH＞6.0时，其是绿色；pH＜6.0时，其是黄色；将这种指示剂配成碱性溶液点加在凝胶表面，凝胶会变成蓝色状态，液体使用0.01mol/L盐酸，在酸性的条件下，凝胶颜色会发生从蓝色到黄色的转变。

（2）结果分析 如图5.19所示为一系列随时间增加凝胶颜色变化图。可看出，在5s之内，蓝色凝胶都完全转化为黄色，说明凝胶和溶液之间能够实现快速的交换。

图5.19 凝胶与溶液交换情况表征(www.daowen.com)

在芯片上细胞能否正常生长是决定该芯片是否可用于细胞的生物学评估的关键因素。凝胶机械稳定性、与交换情况的表征结果证实该芯片可以提供细胞生长所需要的稳定环境，为进行实际的细胞培养奠定了基础。芯片上细胞生长情况的表征如下。

（1）实验过程

①使用PBS配制2%的低熔点琼脂糖凝胶溶液，置于70℃水浴中溶解，振荡形成均匀水溶液。

②处理细胞，得到细胞悬浮液，细胞密度约为10⁶cell/mL。

③将经过30min紫外光灭菌处理的下层和中间层芯片取出、可逆贴合，使用移液枪依次移取2%凝胶0.7μL注入微孔。将芯片放于4℃冰箱5min，凝胶固化。

④使用移液枪再次依次移取0.7μL细胞溶液注入微孔。

⑤重复上步实验，将所有孔阵列皆注入细胞。

⑥使用注射泵和5mL注射器，以5μL/min速度连续灌注细胞培养液。

⑦在显微镜下观察细胞状态，及使用AO-EB（吖啶橙-溴化乙啶）染色观察细胞活性情况。

（2）结果分析 如图5.20所示为将细胞装载到凝胶表面，细胞状态的变化情况。说明在20min内凝胶上的液体可以很快渗透凝胶，将细胞载于凝胶表面；而在持续不断的通入细胞培养液时，细胞的位置是不会发生变化的，可看出在该凝胶界面上可以形成很好的单细胞层。

图5.20 凝胶上单层细胞产生过程（0～12h，凝胶上细胞分布情况的变化）

如图5.21所示为在芯片上进行细胞的长期培养，细胞的活性情况，并且进行统计分析。图5.21（1）为对细胞进行荧光染色情况，图 5.21（2）为对细胞存活率进行统计分析情况。实验对细胞连续培养48h，使用AO-EB（吖啶橙-溴化乙啶）染色，于倒置荧光显微镜下观察。使用蓝光激发，由于AO只进入活细胞，正常的细胞核及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只能进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞核染成橙色。因此，通过在荧光显微镜下细胞显色和形态的不同，将正常细胞和死亡细胞区分开来。实验结果如图5.21（2）所示，培养48h后，细胞几乎无死亡，存活率超过95%，说明该芯片平台可有效地用于细胞的长期培养。

图5.21 芯片上细胞培养

（1）表征方法 为了评估凝胶界面与气溶胶颗粒之间的相互作用能力。实验使用卷烟烟气作为气体污染源，将使用单通道吸烟机收集的新鲜烟气，以4mL/min的流速持续通入芯片管道，经过20min，烟气在凝胶上富集。使用扫描电子显微镜，在凝胶孔阵列附近，拍照分析，并统计颗粒分布。实验以孔附近处颗粒分布，推断确定凝胶上气体颗粒沉积情况。

（2）结果分析 图5.22（1）是凝胶附近颗粒分布SEM图，图5.22（2）是颗粒分布情况的统计数据。研究表明颗粒越小，越容易在肺泡处沉积，对肺部细胞产生生物学效应，而卷烟烟气气溶胶粒径大小绝大多数在1μm以下。因此，可以说明该凝胶气液界面系统可以用于生物学评估，进行细胞的毒理学研究。

图5.22 凝胶附近气溶胶颗粒表征