（1）制作方法 首先采用激光雕刻技术制作模具，然后采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒模技术制作芯片。制作流程如下：

过程如下所述：

①在一片洁净的玻璃片上，依次贴12层PET绿胶带（60μm/层），紧密贴合，防止气泡产生。

②使用激光雕刻机，按设计的图形结构进行雕刻，去除多余部分，得到模板。

③将未固化的聚二甲基硅氧烷（PDMS前聚体∶固化剂=10∶1），铺到上层芯片模板上，真空抽气10min以除去气泡。

④在加热台上于70℃加热固化45min。揭下，即得到上层芯片。

⑤使用打孔器在芯片上相应位置打孔，即可用于使用。

（2）设计与选择 芯片上气体梯度形成原理：两路气体自由扩散，相互稀释。根据这个原理，实验过程中共设计了以下三种上层芯片结构，如图5.8所示。

图5.8 上层芯片设计结构图

（烟气，空气）

如图5.8（1）结构所示，上面黑色箭头处通烟气，绿色箭头处通空气，两路气体依靠自由扩散作用在中间相通的气体通道中形成烟气梯度，从而对下面中间层上的细胞进行暴露；如图5.8（2）结构所示，黑色箭头处通入烟气，在3个拐角处通入空气，这样可以对烟气进行逐步稀释，从而达到形成梯度的目的；如图5.8（3）结构所示，同图5.8（1）结构类似，上面黑色箭头处通烟气，绿色箭头处通空气，区别在于这种结构使烟气能够从中间层细胞上方通过，进行直接暴露。

为验证这三种芯片结构是否可形成梯度，并保证一定的烟气暴露量。对三种芯片形成的气体梯度以及实际烟气暴露量进行表证。

气体梯度表征，由于烟气不具有明显的颜色，且也无法使溶液发生明显的变化，因此在实验过程中使用二氧化碳气体，结合溴百里酚蓝的碱性溶液作为指示剂来指示气体梯度的形成^[33]。该方法的原理：溴百里酚蓝在碱性条件下呈蓝色、酸性条件下呈黄色。溴百里酚蓝的碱性溶液在二氧化碳气体的作用下会逐渐趋向酸性，从而颜色会发生从蓝色到黄色的转变。对凝胶颜色变化过程进行监控至达到稳定状态。

烟气暴露量表征，采用荧光探针DHE染色法，通过倒置荧光显微镜下观察细胞ROS变化情况，该荧光染料，使用绿光激发得红色荧光，荧光强度的大小与细胞内ROS的量呈正相关，据此判断烟气暴露量。(www.daowen.com)

芯片结构A：气体梯度表征结果如图5.9所示。由图可看出，凝胶颜色呈现由蓝色到黄色的梯度变化，说明该芯片结构可以实现气体梯度的形成。烟气暴露结果如图5.10所示。左侧[（1）～（4）] 通的是烟气，右侧[（13）～（16）] 通的是空气，两边细胞ROS荧光强度没有明显差异，无荧光强度的梯度变化。因此，A结构芯片，可以形成梯度，但是这种气体梯度效果没有在使用烟气暴露的实验过程中表现出来，说明烟气剂量不足，并且在这种结构中，烟气靠扩散至细胞表面，没有与细胞直接接触，与细胞暴露烟气的实际状况不相符合。因此，这种结构不能用于下面细胞烟气暴露实验研究。

图5.9 上层芯片结构A气体梯度表征图

图5.10 上层芯片结构A烟气暴露后细胞ROS荧光图

B结构芯片，从进口处通入烟气，在S型芯片通道拐角处分别通入空气，这样各通道烟气可逐步稀释，从而可形成梯度。由于在研究过程中，实验是以在出口处形成一个负压实现气体进入通道的，因此这种情况下根据通道内压力分布，接近出口处拐角的空气更易进入通道，烟气会很少进入，从而造成烟气量的不足。实验同样以烟气暴露后，DHE荧光染色观察，结果如图5.11所示。由图可看出荧光强度很弱且没有明显梯度变化，说明烟气剂量不足，因此这种结构同样也不能用于细胞烟气暴露研究。

芯片结构C，同A结构类似，一边通烟气，另一边通空气，区别在于这种情况下烟气与空气直接在芯片管道中稀释混合，烟气能够从中间层细胞上方通过进行直接暴露。从理论上来说，该方案既解决了烟气量不足的问题，又能够形成梯度，实验同样以烟气暴露后，DHE荧光染色观察，结果如图5.12所示。由图可看出ROS荧光强度依次递增，说明烟气在芯片中呈梯度变化，因此这种结构可用于细胞烟气暴露研究。

图5.11 上层芯片结构B烟气暴露后细胞ROS荧光图

图5.12 上层芯片结构C烟气暴露后细胞ROS荧光图

综上所述，可知只有结构C的上层芯片能够实际实现芯片上烟气梯度的暴露。究其原因，结构A能够产生梯度，但是这种情况下烟气量明显不足；结构B虽然可使烟气从细胞上方通过，但是这种结构会使烟气进入管道的量很少，烟气量明显不足。而结构C，既能够保证烟气量，又能够形成梯度，同时烟气自细胞上方通过直接与细胞进行接触，这与细胞暴露烟气的实际状况相符合。因此，实验选用结构C作为上层芯片。其制作过程如上所示，得到的芯片模板实物图如图5.13所示。

图5.13 上层芯片PET模板（每层60μm，共12层，芯片管道深度720μm）

（1）表征方法 对于气体梯度表征，实验使用二氧化碳气体，结合溴百里酚蓝的碱性溶液作为指示剂来指示气体梯度的形成^[33]，原理如上所述。

具体过程：①使用PBS配制的浓度为2%低熔点琼脂糖凝胶（m/V），使溶解呈液态。②使用移液枪，在每个孔中点加0.7μL凝胶，放置4℃冰箱中5min，待凝胶固化。③将配好的呈碱性的溴百里酚蓝溶液在每个孔中点加0.7μL，室温放置10min，溴百里酚蓝溶液渗入凝胶中。④将芯片贴合，以4mL/min的流速、20min暴露时间，于两个进气口，一边通二氧化碳、一边通空气。⑤在直筒显微镜下，监测凝胶颜色变化。⑥使用Image J软件对各通道凝胶进行色度分析，分析其梯度变化。

（2）结果分析 如图5.14所示为得到的芯片气体梯度颜色变化图，使用Image J软件对各通道凝胶对其进行色度分析，作得右侧图5.14（2）线性变化图，横坐标1、2、3、4对应于图5.14（1）中各通道，纵坐标是各通道凝胶颜色色度值大小；线性拟合得到直线方程：Y=32.85X-30.55，R²=0.9936，可看出线性变化良好，说明此芯片平台可形成稳定的线性变化。此上层芯片对于气体而言可形成良好的线形变化，可用于烟气刺激细胞实验。

图5.14 上层芯片气体梯度表征