基于全烟气暴露细胞毒性测试方法中优化的烟气暴露条件，针对体外微核试验中可能存在的影响因素进行条件优化，主要优化的影响因素有低渗条件、细胞制片方法等。

合适的低渗时间对后续的微核计数影响很大，低渗液的作用是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，易于观察。如图4.27所示，未经低渗液处理的细胞的细胞核和细胞质分离不明显，随着低渗时间的延长，细胞膨胀，镜下可以清晰地看到细胞核形态，低渗时间在2～6min较为合适，低渗处理8min时，镜下看到着色的细胞核，无法看到完整的细胞形态，细胞因过度低渗作用而造成细胞膜破裂。如图4.28所示，在37℃条件下进行低渗处理细胞，细胞形态较室温下处理时细胞核和细胞质分离清晰，便于观察。以上结果提示，低渗时间和低渗温度是获得良好的细胞形态和观察结果的重要影响因素。

图4.27 低渗时间对细胞形态的影响（1）；（2）；（3）；（4）；（5）

图4.28 低渗温度对细胞形态的影响

比较了传统的消化细胞滴片法和不经消化的爬片法进行低渗、固定细胞后的染色结果，如图4.29所示，两种处理方法均可获得良好的细胞形态，经滴片法处理后镜下观察细胞分散较均匀，便于计数；而爬片法处理后镜下观察细胞有成团聚集现象，同时Transwell小室的膜对背景有一些影响，不方便计数。

图4.29 滴片法与爬片法比较

为了评价建立的测试方法的稳定性，选择3R4F参比卷烟在不同时间进行全烟气暴露体外微核测试。分别于3个不同工作日开始全烟气暴露实验，考察了测试方法的日内重复性和日间重复性，评价结果如（表4.27～表4.30）所示，使用建立的方法进行全烟气暴露实验，烟气诱导体外微核发生率的测试结果变异系数（CV）在65%以内。由于微核率的计算采用人工肉眼计数，存在一定人为主观因素的影响和误差。

表4.27 测试方法的日内精密度（ISO）

表4.28 测试方法的日内精密度（HCI）

表4.29 测试方法的日间精密度（ISO）

表4.30 测试方法的日间精密度（HCI）

采用建立的卷烟全烟气暴露体外微核测试方法对市售卷烟样品进行了测试，由于样品数量较多，一次试验的测试周期较长，对于测试样品的全烟气暴露实验均为一次暴露试验，每次试验设置3个平行。30个卷烟样品的全烟气暴露体外微核诱发率结果如表4.31所示。(www.daowen.com)

表4.31 卷烟样品全烟气暴露体外微核诱发率结果

比较测试的市售卷烟样品的全烟气体外微核诱发率结果，以比活性为表征指标（表4.32），结果显示，在测试的卷烟样品中，国内卷烟样品的比活性略低于国外卷烟样品（图4.30），无显著性差异；烤烟型卷烟样品的比活性略低于混合型卷烟样品（图4.31），无显著性差异。

表4.32 微核率（‰）与烟气剂量（%烟支数）回归拟合方程及比活性

续表

图4.30 国内外卷烟样品的全烟气体外微核率比较

图4.31 不同类型卷烟样品的全烟气体外微核率比较

进一步比较了不同焦油释放量卷烟的遗传毒性差异，选取混合型卷烟一组（焦油释放量分别为8mg、5mg、3mg）分别进行测试。根据比活性表征的结果（图4.32）显示，当抽吸卷烟烟支数相同时，烟气诱发微核发生率呈现出随焦油释放量降低而减小的趋势。

图4.32 不同焦油释放量卷烟遗传毒性比较

为了比较抽吸条件对卷烟烟气遗传毒性的影响，选择3R4F参比卷烟分别在ISO和HCI条件下进行全烟气暴露实验，体外微核测试数据以比活性为表征指标，当以烟支数为剂量单位与微核率拟合方程时（表4.33），结果显示，当抽吸相同支数的卷烟时，在ISO条件下产生的烟气的遗传毒性小于HCI条件下产生的烟气的遗传毒性。当以TP M为剂量单位与微核率拟合方程时（表4.34），在ISO条件下产生的烟气的遗传毒性大于HCI条件下产生的烟气的遗传毒性。

表4.33 不同抽吸条件下3R4F参比卷烟烟气遗传毒性比较（以%烟支数为剂量单位）

表4.34 不同抽吸条件下3R4F参比卷烟烟气遗传毒性比较（以μg TPM为剂量单位）