在搭建的全烟气暴露实验平台上进行细菌致突变性测试，优化了实验条件，主要包括：菌株选择、稀释空气流速、烟气剂量、菌株培养条件及S9浓度。

以Ames试验的基本配套菌株（TA97、TA98、TA100和TA102）作为研究对象，3R4F参比卷烟的TPM为受试物，采用平板掺入法进行指标测试。TA97、TA98、TA100和TA102四种菌株可以检出的突变型有所不同，其中TA97和TA98可以检出移码突变，而TA100和TA102可以检出碱基置换和移码突变。

TPM的Ames试验结果如表4.11所示，显示在250～5000μg/mL的剂量范围内，TP M对TA97、TA100和TA102平均每皿诱发的回复突变菌落数均低于自发突变菌落数的2倍，都未显示出诱变作用。在加S9的情况下，1000μg/mL的TP M引起的回复突变菌落数高于自发突变菌落数的2倍，对TA98有诱变作用，并显示出剂量-反应关系。由表4.11也可以看出，TA98和TA100较TA97和TA102对TP M敏感，且TA98和TA100的组合也能检测出移码突变和碱基置换，因此项目以TA98和TA100作为Ames试验的测试菌株。

表4.11 不同剂量TPM对4种沙门氏菌株诱发的回复突变菌落数

注：∗ 回复突变菌落数是自发突变菌落数的2倍以上。

在进行全烟气暴露试验之前，首先对稀释烟气进入暴露仓的流速进行优化。在VITROCELL VC10吸烟机上设置4孔道抽吸模式，每孔道抽吸1支卷烟。新鲜烟气由抽吸针筒迅速注入烟气稀释装置，经洁净空气稀释后，不连续的烟气气溶胶可持续进入Ames暴露仓。

以对TP M较为敏感的TA98和TA100菌株为全烟气染毒的研究对象。增菌培养后，吸取新鲜菌液50μL、融化的顶层培养基（0.5%琼脂粉，0.6%NaCl，0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液）700μL、和10% S9混合液250μL，混匀后，迅速倾倒于35mm的底层平板上，平铺完全后，置于Ames暴露仓。将4个稀释装置设定一致的洁净空气流速（0.5L/min），并分别设置5，10，50和100mL/min的稀释烟气流速，打开吸烟机，进行全烟气暴露的Ames试验。全烟气染毒结束后，平板于37℃继续培养48h，计数各平板的回变菌落数。

5，10，50和100mL/min的稀释烟气对Ames试验结果的影响表明，随着稀释烟气流速的增加，TA98和TA100回变菌落数持续降低（图4.20）。可能稀释烟气流速太大，导致卷烟烟气粒相部分较难沉积于底层平板，气相部分与细菌接触时间也相继缩短，不能有效地对细菌产生作用；或是大的流速直接对细菌造成死亡，从而导致平板的回变菌落数降低。因此在进行全烟气的试验时，进入暴露仓的稀释烟气流速选择5mL/min。

图4.20 暴露仓内稀释烟气流速对回变菌落数的影响

吸取菌液50μL，融化的顶层培养基700μL和10% S9混合液250μL，混匀后，迅速倾倒于底层平板上，平铺完全后，置于Ames暴露仓。设置单孔道抽吸模式，以0.5L/min的洁净空气进行烟气稀释，稀释烟气以5mL/min进入暴露仓，分别进行1，2，3，4，5和6支卷烟的抽吸，全烟气染毒后，平板于37℃继续培养48h，计数各平板的回变菌落数。

设置0.5L/min的洁净空气流速，稀释烟气以5mL/min进入Ames暴露仓。采用不同数量的烟支分别进行TA98和TA100的全烟气染毒Ames试验。结果显示（图4.21），抽吸卷烟从1～3支的范围内，回变菌落数呈增加趋势，随着烟支数的增加，回变菌落数开始下降。烟支数的增加，可能使染毒时间及烟气粒相部分的沉积相继增加，从而引起回变菌落数的增加；但是随着烟支数量的增加，回变菌落数又出现降低，可能是因为大剂量的烟气造成部分细菌死亡或是出现了细菌抑制作用。同时结果还显示，染毒4支卷烟时开始出现回变菌落数的下降，说明4支卷烟已经产生了细菌抑制作用，由此选择4支卷烟为最大染毒烟支数。

图4.21 染毒的烟支数量对每平板回变菌落数的影响

含顶层培养基的Ames试验：首先将菌液50μL、10% S9混合液250μL、组氨酸-生物素溶液50μL和融化的上层培养基700μL混匀后，迅速倾倒于底层平板上，待平铺完全后，置于Ames暴露仓。

无顶层培养基的Ames试验：直接将菌液50μL、10% S9混合液250μL和0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液50μL混匀，而后将混合溶液倾倒于底层平板上，平铺完全后置于Ames暴露仓。

两种方法均为4孔道抽吸模式，每个孔道抽吸4支卷烟，洁净空气流速分别为0.5，1.0，1.5和2.0L/min，稀释烟气以5mL/min进入暴露仓。将A-mes暴露仓与烟气稀释装置连接，进行全烟气染毒。两种方法均设置空气对照和蒽胺阳性对照，全烟气染毒结束后，平板于37℃继续培养48h，计数各平板的回变菌落数。

采用含顶层培养基和不含顶层培养基两种方法进行全烟气暴露的Ames试验后，结果（图4.22）表明，各烟气剂量中，无顶层培养基的回变菌落数比传统含顶层培养基的回变菌落数高，并表现出剂量依赖性，这是由于无顶层培养基平板中的细菌可以直接与烟气接触，使烟气的遗传毒性作用表现的更加充分。

按照无顶层培养基的方法，分别采用5%、10%和30%的S9混合液，与菌液和组氨酸-生物素溶液混匀后，迅速倾倒于35mm的底层平板上，平铺完全后，置于Ames暴露仓，连接烟气稀释装置。设置4孔道抽吸模式，每个孔道抽吸4支卷烟，洁净空气流速分别为0.5，1.0，1.5和2.0L/min，稀释烟气进入暴露仓的速率为5mL/min，进行全烟气染毒，并设置空气对照和阳性对照，烟气染毒后，37℃继续培养48h，计数各平板的回变菌落数。

图4.22 顶层培养基对烟气遗传毒性的影响

表4.12所示为S9可以使间接致突变物蒽胺表现出阳性，说明S9的活化能力正常。不同S9浓度对回变菌落的影响表明，随着S9浓度的增加，各平板的回变菌落数也相应增加（图4.23）。图4.24所示为10% S9混合液进行活化时TA98的回变菌落情况。

表4.12 各Ames试验中阳性对照的回变菌落情况

图4.23 不同S9浓度下各剂量烟气的回变菌落数

图4.24 稀释烟气在10% S9混合液活化情况下回变菌落情况

每平板的洁净空气流速分别为（1）2.0L/min；（2）1.5L/min；（3）1.0L/min；（4）0.5L/min。

传统的Ames试验采用平板掺入法，将受试物、菌液和S9（加或不加）加入顶层培养基混匀后，均匀平铺于90mm的底层平板上。本研究采用Ames暴露仓对烟气的致突变作用进行评价，Ames暴露仓可同时放入3个35mm的平皿，与传统的Ames试验一样，每个剂量可以设置3个平行。

卷烟烟气为复杂的气溶胶，大部分为气相成分，本研究采用的Ames暴露仓可以进行包括烟气在内的气体或气溶胶的Ames试验研究。研究发现，影响烟气遗传毒性的因素较多，如稀释烟气流速、染毒的卷烟支数和顶层培养基等。稀释烟气进入Ames暴露仓的流速越大，稀释烟气传送较快，导致烟气的粒相物沉积减少，缩短了烟气与细菌的接触时间，从而影响烟气的诱变作用。从染毒的烟支数对试验结果的影响来看，随着烟支数的增加，细菌回复突变数增加到一定程度时开始下降，高的烟气浓度出现了抑菌作用，从而直接影响到卷烟烟气毒性作用的表现。

从Ames相关研究发现，化合物对细菌的致突变作用与化合物跟细菌接触时间和接触方式有关，据此，研究了顶层培养基对回变菌落的影响，发现无顶层培养基时，卷烟烟气的致突变能力比含顶层培养基时有所增加。这是由于细菌在顶层培养基中时，卷烟烟气仅与固态培养基表面的细菌接触，如果不存在顶层培养基，烟气可直接与细菌接触，使得烟气遗传毒性作用更明显的表现出来。同时，S9的浓度对烟气的遗传毒性也存在影响，30%的S9，可以更有效地评价卷烟烟气的致突变作用。但考虑到10%的S9也表现出活化作用，而且从成本考虑，10%的S9为最佳选择。(www.daowen.com)

为了评价建立的测试方法的稳定性，选择3R4F参比卷烟在不同时间进行全烟气暴露下的Ames测试。分别于3个不同工作日开始全烟气暴露实验，每次试验设置3个平行。TA98和TA100菌株的测试结果见表4.13～表4.20。在本实验中建立的基于全烟气暴露的Ames测试方法的CV值在35%以内，表明测试方法的稳定性较好。

表4.13 测试方法的日内精密度（TA98菌株）（ISO）

表4.14 测试方法的日内精密度（TA98菌株）（HCI）

表4.15 测试方法的日间精密度（TA98菌株）（ISO）

续表

表4.16 测试方法的日间精密度（TA98菌株）（HCI）

表4.17 测试方法的日内精密度（TA100菌株）（ISO）

表4.18 测试方法的日内精密度（TA100菌株）（HCI）

续表

表4.19 测试方法的日间精密度（TA100菌株）（ISO）

表4.20 测试方法的日间精密度（TA100菌株）（HCI）

采用建立的卷烟全烟气暴露Ames测试方法对市售卷烟样品进行了测试，由于样品数量较多，一次试验的测试周期较长，对于测试样品的全烟气暴露实验均为一次暴露试验，每次试验设置3个平行。30个卷烟样品的Ames试验结果如表4.21和表4.22所示。

表4.21 卷烟样品全烟气暴露的Ames试验结果（TA98菌株）

表4.22 卷烟样品全烟气暴露的Ames试验结果（TA100菌株）

比较不同类型卷烟的致突变性，以比活性为表征指标（表4.23和表4.24），进口烤烟型和混合型卷烟的比活性均高于国产烤烟型和混合型卷烟（图4.25）。单因素方差分析结果显示，国产烤烟型卷烟与进口混合型卷烟之间引起TA98致突变性的差别有统计学意义（P＜0.05）。

表4.23 回突变菌落数与烟气剂量（支）回归拟合方程及比活性（TA98）

续表

表4.24 回突变菌落数与烟气剂量（支）回归拟合方程及比活性（TA100）

续表

图4.25 不同类型卷烟对TA98和TA100的比活性

进一步比较了不同焦油释放量卷烟的致突变毒性差异，选取混合型卷烟一组（焦油释放量分别为8mg、5mg、3mg）分别进行测试。以比活性表征的结果显示（图4.26），当抽吸卷烟烟支数相同时，不同焦油释放量卷烟之间的烟气致突变性无统计学差异。

为了比较卷烟抽吸条件对烟气致突变性的影响，选择3R4F参比卷烟分别在ISO和HCI条件下进行全烟气暴露实验，Ames测试数据以比活性为表征指标，当以烟支数为剂量单位与回突变菌落数拟合方程时（表4.25），TA98菌株和TA100菌株的测试结果均显示，当抽吸相同支数的卷烟时，在ISO条件下产生的烟气的致突变性小于HCI条件下产生的烟气的致突变性。当以TPM为剂量单位与回突变菌落数拟合方程时（表4.26），在ISO条件下产生的烟气的致突变性大于HCI条件下产生的烟气的致突变性。

图4.26 不同焦油释放量卷烟致突变性比较（TA98）

表4.25 不同抽吸条件下3R4F参比卷烟烟气致突变性比较（烟支数为剂量单位）

表4.26 不同抽吸条件下3R4F参比卷烟烟气致突变性比较（μg TPM为剂量单位）