在搭建的全烟气暴露实验平台上进行细胞毒性测试，优化了实验条件，主要包括：洁净空气流速、烟气剂量、烟气暴露恢复时间、环境温度及细胞敏感性。

在进行全烟气暴露实验时，测试细胞暴露于持续流动的烟气环境中。为了评价暴露装置内烟气流速和稀释卷烟主流烟气的洁净空气对测试细胞存活的影响，CHO细胞直接于不同流速（5，10，15，20mL/min）的洁净空气中暴露15～60min，随后转置培养箱（37℃、5% CO₂）中继续培养24h。未经洁净空气暴露的CHO细胞作为对照组。CHO细胞暴露于4个不同流速的洁净空气中30min，如图4.9（1）所示，随着气流速度的增加，细胞存活率呈现降低趋势，5mL/min的气流速度对细胞存活率的影响与对照组细胞相比无明显差异，而继续增大气流速度对细胞存活率的影响与对照组细胞相比呈显著性差异（气流速度10mL/min和15mL/min时，对细胞存活率的影响存在显著性差异P＜0.05；气流速度20mL/min时，对细胞存活率的影响存在极显著性差异P＜0.01）。同时，CHO细胞在5mL/min的洁净空气中暴露时，随着暴露时间的延长，细胞存活率没有下降[图4.9（2）]。结果表明，在建立的全烟气暴露实验系统中，洁净空气对测试细胞没有明显的细胞毒性作用，暴露装置中气流速度在5mL/min时对测试细胞的存活无明显影响。根据上述实验结果，在进行全烟气暴露实验时，对照组细胞暴露于洁净空气中，暴露装置中烟气流速设置在5mL/min。

图4.9 洁净空气暴露对细胞存活的影响（n=3）

在进行细胞毒性测试时，染毒剂量范围影响到合适的剂量-效应关系曲线的获得。为了优化合适的烟气暴露剂量，CHO细胞同时暴露于经4个不同流速（0，0.75，2.25和3.75L/min）的洁净空气稀释的烟气剂量下，每个烟气剂量组抽吸2支或4支或8支3R4F参比卷烟，烟气暴露结束后细胞于37℃、5% CO₂条件下继续培养24h。结果（图4.10）显示，在ISO和HCI抽吸条件下，每个烟气剂量组抽吸2支或4支或8支3R4F参比卷烟时，烟气剂量与细胞存活率之间均存在剂量-效应关系，其中以每个烟气剂量组抽吸4支卷烟时可以获得较好的烟气细胞毒性剂量-效应关系，即在烟气剂量范围内，CHO细胞存活率较为均匀地分布在20%～95%（表4.3和表4.4）。以上结果表明，建立的全烟气暴露实验方法用于测试卷烟全烟气的细胞毒性是合适的，可以获得较好的烟气细胞毒性的剂量-效应关系。

图4.10 全烟气细胞毒性的剂量-效应关系（n=3）

表4.3 ISO条件下烟气剂量选择与细胞存活率范围

表4.4 HCI条件下烟气剂量选择与细胞存活率范围

细胞暴露卷烟烟气后，需要经过一定的时间才能反映出烟气的细胞毒性作用。CHO细胞同时暴露于经4个不同流速（0，0.75，2.25和3.75L/min）的洁净空气稀释的烟气剂量下，每个烟气剂量组抽吸4支3R4F参比卷烟，烟气暴露结束后细胞于37℃、5% CO₂条件下继续培养3h或24h。结果显示（图4.11），感受卷烟烟气的CHO细胞恢复培养24h后，烟气引起的细胞毒性作用明显高于恢复培养3h时的细胞毒性。以上结果提示，在进行卷烟全烟气暴露的细胞毒性测试实验时，细胞经烟气暴露后恢复培养24h可以较为充分地反映出烟气的细胞毒性影响。

图4.11 全烟气暴露后恢复时间对细胞毒性测试的影响（n=3）

为了研究测试细胞进行卷烟烟气暴露时，培养细胞的环境温度对细胞毒性测试结果的影响，CHO细胞同时暴露于经4个不同流速（0，0.75，2.25和3.75L/min）的洁净空气稀释的烟气剂量下，每个烟气剂量组抽吸 4支3R4F参比卷烟。进行烟气暴露时，细胞处于室温或37℃环境温度下，恒温水浴装置可保持烟气暴露装置中的细胞处于37℃环境温度下。烟气暴露结束后细胞于37℃、5% CO₂条件下继续培养24h。结果显示（图4.12），细胞处于室温条件下进行全烟气暴露实验时，卷烟烟气可发生凝集作用，沉积吸附于培养皿壁，肉眼可见淡黄色烟气粒相物，稀释因子为1的烟气暴露组最为明显。细胞处于37℃环境条件下进行全烟气暴露实验时，卷烟烟气的凝集作用较弱。沉积吸附于培养皿壁的烟气粒相物将干扰随后的中性红摄取试验的颜色反应，使得测试结果不准确。因此，在进行全烟气暴露实验时，培养细胞维持37℃环境温度较为适宜。

选择在评价卷烟烟气冷凝物细胞毒性时常用的2种细胞系（CHO细胞和A549细胞）进行比较。测试细胞同时暴露于经 4个不同流速（0，0.75，2.25和3.75L/min）的洁净空气稀释的烟气剂量下，每个烟气剂量组抽吸4支3R4F参比卷烟，烟气暴露结束后细胞于37℃、5% CO₂条件下继续培养24h。结果显示（图4.13），卷烟烟气对CHO细胞的细胞毒性作用大于对A549细胞的细胞毒性作用，在稀释因子较高的烟气暴露下，CHO细胞的存活率低于A549细胞的存活率。以上结果表明，CHO细胞较A549细胞对卷烟主流烟气的细胞毒性作用敏感。

图4.12 烟气暴露时环境温度对细胞毒性测试的影响（n=3）

图4.13 不同细胞系对卷烟烟气细胞毒性的敏感性（n=3）

为了评价建立的测试方法的稳定性，选择3R4F参比卷烟在不同时间进行全烟气暴露试验测试卷烟烟气的细胞毒性。分别于4个不同工作日开始全烟气暴露实验，每次试验设置 3个平行。实验次数与每次试验平行数目如表4.5。

表4.5 实验次数与每次试验平行数目

对建立的测试方法的稳定性评价考察了测试方法的日内重复性和日间重复性，评价结果如表4.6～表4.9所示，结果显示，使用建立的方法进行全烟气暴露实验，烟气细胞毒性的测试结果的变异系数（CV）在30%以内。生物学测试实验侧重于对生物学效应的定性分析，实验结果受测试细胞生长状态、细胞传代次数、测试环境、试剂批次、操作人员等多种因素的影响，测试结果的绝对数值随不同时间的测试实验而波动较大。然而，对于定性的测试评价每次实验以及不同实验室的测试结果的定性（变化趋势）结果应该保持较好的一致性。一般地，在进行生物学实验时，每次实验必须设置合适的对照组，比较实验组与对照组测试指标的变化趋势，测试指标的绝对数值仅用于定性比较。因此，在考察卷烟烟气细胞毒性测试方法的稳定性时，测试结果的CV值偏大属于正常，在本实验中建立的基于全烟气暴露的细胞毒性测试方法的CV值在30%以内，表明测试方法的稳定性较好。

表4.6 测试方法的日内精密度（ISO）(www.daowen.com)

表4.7 测试方法的日内精密度（HCI）

表4.8 测试方法的日间精密度（ISO）

表4.9 测试方法的日间精密度（HCI）

采用建立的卷烟全烟气暴露细胞毒性测试方法对市售卷烟样品进行了测试，由于样品数量较多，一次试验的测试周期较长，对于测试样品的全烟气暴露实验均为一次暴露试验，每次试验设置3个平行，测试结果的变异系数基本保持在20%以内。30个卷烟样品的全烟气暴露细胞毒性结果见表4.10。

表4.10 卷烟样品的全烟气暴露细胞毒性测试结果

比较测试的市售卷烟样品的全烟气细胞毒性测试结果，发现在测试的卷烟样品中，国内卷烟样品的全烟气细胞毒性略低于国外卷烟样品的全烟气细胞毒性（图4.14），无显著性差异；烤烟型卷烟样品的全烟气细胞毒性略低于混合型卷烟样品的全烟气细胞毒性（图4.15），无显著性差异。

图4.14 国内外卷烟样品的全烟气细胞毒性比较

图4.15 不同类型卷烟样品的全烟气细胞毒性比较

进一步比较了不同焦油释放量卷烟的细胞毒性差异，选取烤烟型卷烟一组（焦油释放量分别为12mg、5mg、1mg）和混合型卷烟一组（焦油释放量分别为8mg、5mg、3mg）分别进行测试。结果（图4.16和图4.17）显示，当抽吸卷烟烟支数相同时，烟气细胞毒性呈现出随焦油释放量降低而减小的趋势，烤烟型卷烟组和混合型卷烟组的结果相一致。

为了评价卷烟主流烟气中气相组分的细胞毒性，进行全烟气暴露实验时在吸烟机抽吸针筒和烟支端口之间的气路处连接一个92mm的剑桥滤片，吸烟机抽吸产生的主流烟气中的粒相组分被捕集在滤片上，气相组分透过滤片经4个不同流速（0，0.75，2.25和3.75L/min）的洁净空气稀释后暴露CHO细胞，每个烟气剂量组抽吸4支3R4F参比卷烟，烟气暴露结束后细胞于37℃、5% CO₂条件下继续培养24h。结果[图4.18（1）] 显示，在不同烟气剂量下，全烟气的细胞毒性均大于烟气气相组分的细胞毒性；随着烟气剂量的增加，气相组分的细胞毒性作用占全烟气细胞毒性作用的比例逐渐增大，在较高烟气剂量时气相组分的细胞毒性占全烟气细胞毒性作用的50%以上[图4.18（2）]。以上结果表明，烟气气相组分在全烟气的毒性效应方面起着重要的作用，同时，采用全烟气暴露的实验方法可以很好的区分卷烟全烟气和烟气气相组分的细胞毒性。

图4.16 不同焦油释放量烤烟型卷烟细胞毒性

图4.17 不同焦油释放量混合型卷烟细胞毒性

图4.18 卷烟全烟气和烟气气相组分的细胞毒性比较（n=3）

为了比较不同抽吸方式对卷烟烟气细胞毒性的影响，分别对卷烟烟气TPM和全烟气进行了细胞毒性测试。3R4F参比卷烟TPM的细胞毒性测试结果[图4.19（1）] 显示，在HCI抽吸条件下卷烟主流烟气TPM的细胞毒性小于ISO抽吸条件下TP M的细胞毒性。全烟气暴露的细胞毒性测试结果[图4.19（2）和（3）] 显示，若以%烟支数为烟气单位，则在抽吸相同数量卷烟的前提下，HCI抽吸时主流烟气的细胞毒性大于ISO抽吸下的细胞毒性；然而，当转换为TPM的累积暴露量时，HCI抽吸时主流烟气的细胞毒性小于ISO抽吸下的细胞毒性。表明，不同表征方式的烟气剂量单位将影响卷烟烟气细胞毒性的排序，应依据不同的实验目的选择合适的烟气单位。

图4.19 不同抽吸方式对卷烟烟气细胞毒性的影响（t检验^∗P＜0.05，^∗∗P＜0.01）