以上的卷烟烟气体外毒性研究均采用二维细胞培养体系。细胞在二维平板培养过程中是附着在底物平面上生长，因缺少立体支架，只能向二维发展，因而会失去其在体内时的立体形态及生化和功能性。因此，采用二维单层细胞体系进行烟草制品体外毒理学评价的结果存在一定的局限性。三维细胞支架可为细胞提供与体内相似的支架系统，有利于创造与体内类似的生长环境，进而促使细胞增殖、分化及呈现类似体内的组织结构和功能性状，因此以其为载体的三维细胞培养体系已成为体外细胞培养体系的重要发展方向之一。

近年来，三维细胞支架已应用于组织工程、再生医学、药物研发等领域，支架材料主要包括天然生物可降解高分子材料（壳聚糖、纤维蛋白、胶原蛋白等）、合成高分子材料（聚乙二醇、聚苯乙烯、聚己内酯、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物）等。研究采用高内相乳液法制备三维细胞支架，以其为载体进行三维细胞培养和CSC的细胞毒性评价^[90]。由高内相乳液法制备的聚合物互通多孔材料具有大量的泡孔，且泡孔之间有窗孔相连，因此具有孔隙率高、密度低、比表面积大和物质输送能力强等优点，已在生物组织工程、吸附与分离、催化、传感器、分子识别以及环境科学等方面得到了较多的应用。

高内相乳液法制备三维细胞支架的流程如图2.7所示，各油/水相的组成如表2.4所示。将油相加入三口圆底烧瓶中，用聚四氟乙烯搅拌棒在300r/min下搅拌，并逐滴加入水相，滴加完毕后，继续搅拌30min；将乳液倒入自制容器内，60℃下聚合24h；分别以异丙醇和水为溶剂，采用索氏提取法提取24h，将三维细胞支架真空干燥后备用。取干燥后的三维细胞支架，按照垂直方向的截面切片，喷金后用扫描电子显微镜观察其形貌。采用傅里叶变换红外光谱仪对三维细胞支架的组成进行表征（溴化钾压片法）。

图2.7 三维细胞支架的制备流程

表2.4 高内相乳液的组成 单位：g(www.daowen.com)

制备了未改性和改性两种三维细胞支架，A549细胞在未改性和亲水改性的三维细胞支架上均能增殖并融合形成细胞层，但在改性支架上增殖更快。在细胞培养前7d，二维细胞培养体系的细胞增殖情况明显优于三维细胞培养体系。原因是细胞在二维细胞培养体系中能迅速贴壁和增殖，但三维细胞支架的内部网状结构使细胞无法迅速贴壁和增殖。细胞培养14d后，两种培养体系的结果接近；培养21d后，三维细胞培养体系的细胞数超过二维培养体系。可见，三维细胞支架的立体结构在细胞培养方面具有独特的作用。

选用两种不同焦油量的卷烟样品（3R4F参比卷烟和CM8参比卷烟）考察了三维细胞支架在卷烟烟气细胞毒性评价中的应用效果。使用CCK-8试剂分别检测两种卷烟烟气TP M对A549细胞的毒性效应，染毒前使二维和三维细胞培养体系的细胞数处于同一范围内。结果显示，两种卷烟的TPM浓度均与二维和三维培养体系的A549细胞存活率之间存在良好的剂量-反应关系，说明三维培养体系下的 A549细胞符合细胞毒性评价的基本规律。随着TPM浓度的增加，三维培养体系下的细胞存活率高于二维培养体系。该研究结果反映了三维细胞培养与二维细胞培养的区别和优势。在三维细胞支架中生长的细胞会形成与在体内类似的三维梯度，但在二维培养条件下细胞无法形成三维梯度。该三维梯度可能会使TPM对细胞的渗透性产生差异，从而导致高TP M浓度下三维培养体系的细胞表现出较高的存活率。

[1] 溴甲酚紫，别名溴甲酚红、二溴邻甲酚磺酞等，可用作酸碱指示剂，其pH变色范围为5.2（黄色）～6.8（紫色）。

[2] Ki-67是一种与核糖体RNA转录有关的核蛋白，单克隆抗体Ki-67识别的抗原与增殖相关，由MKI-67基因编码，又称之为MKI-67。Ki-67失活，核糖体RNA合成受限，可作为细胞增殖的标记物。Ki-67在细胞增殖的各期（G1，S，G2和M）中均有表达，但在细胞静止期（G0期）不表达。在病理免疫组化中经常用到，提示细胞的增殖活跃程度。在病理报告中的指数高低与许多肿瘤分化程度、浸润、转移及预后密切相关。