细胞凋亡(apoptosis)是指细胞在基因及相关信号通路调控下自主地有序地死亡。细胞凋亡的检测方法[51]包括:
(1)线粒体膜电位检测 线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)是指跨越线粒体内膜两侧的电化学势,ΔΨm的改变与细胞凋亡密切相关,引起ΔΨm改变的因素均有可能导致细胞凋亡的发生,ΔΨm的改变发生在细胞凋亡最早期,早于磷脂酰丝氨酸外翻、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化及核酸酶的激活。
(2)磷脂酰丝氨酸外翻检测 磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)位于细胞膜内侧,是细胞膜磷脂的重要组成成分。在细胞发生凋亡的早期,细胞内ATP供能不足,胞浆Ca2+浓度升高,氨基磷脂转移酶(Aminophosphatidyl Transferase,APT)活性下降,导致PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面。PS外翻是细胞早期凋亡最明显的标志,可用AnnexinV联合碘化丙啶(PI)染色法对此进行检测。
(3)细胞色素C的定位检测 正常情况下,细胞色素C定位于线粒体膜间隙,与线粒体内膜外侧松弛结合,且不能通过外膜。细胞凋亡引起细胞色素C释放到胞质,caspases-3活化,进一步激活下游的caspase-3、6、7,引发级联反应。
(4)caspase-3活性检测caspase通常以酶原形式存在,被激活后可介导蛋白酶级联反应,是凋亡信号通路的执行者。其中caspase-3 是关键的凋亡效应分子,在死亡受体途径、线粒体途径及内质网途径中均发挥功能。
(5)细胞凋亡形态检测 细胞凋亡形态学特征性改变包括细胞体积变小、胞膜皱缩、核质浓缩、胞膜起泡(bubbling)以及出现凋亡小体等。
(6)DNA片断检测细胞凋亡引起内源性核酸内切酶激活,基因组DNA降解形成约 180~200bp或其整数倍的DNA片段,进行凝胶电泳后可得到DNA梯状条带(DNA ladder),可用于细胞凋亡判断。(www.daowen.com)
(7)细胞膜通透性检测 在细胞凋亡晚期,细胞膜的通透性增加,外部物质可以透过细胞膜进入细胞内部,检测细胞通透性变化的方法多依据此原理进行设计。
目前,国内外也有关于卷烟烟气对细胞凋亡影响的研究。CSC染毒的研究总结如表2.1所示。
图2.3 免疫荧光分析结果(绿色AIF信号与蓝色核染色共定位)[14]
表2.1 国内外卷烟烟气冷凝物的细胞凋亡研究
续表
注:*LC3-II(自噬体特异性形式)与LC3-I(细胞浆形式)的比值是诱导自噬的指标之一。
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