卷烟烟气是含有多种有害成分的复杂气溶胶^[18]，其中有69种已经确定为致癌物^[19]，如B [a] P^[20]、二甲基亚硝胺^[21]、多环芳烃^[22]等。研究表明，随着人体长期吸烟，烟气中的遗传毒性有害成分会长期低剂量暴露于人体呼吸道等组织中，可直接或间接损伤暴露者的DNA从而使遗传物质在基因、染色体水平上发生改变，进而引起遗传毒性效应。在对卷烟烟气进行毒性评价时，除了细胞毒性外，还需要评价卷烟烟气的遗传毒性。2012年，CORESTA烟草烟气体外毒性测试工作组提出了用于评价卷烟烟气体外遗传毒性的两项测试试验，Ames试验和体外微核试验，这也是目前国内外使用频率最高的两项遗传毒性试验，其他还有彗星试验、哺乳动物细胞TK基因突变试验、染色体畸变试验等。

Ames试验是从核酸水平研究化学物的毒性作用，具有快速、有效、经济的特点，其敏感度和特异度为80%～90%^[23]，是目前国际上普遍采用的检测环境中大量潜在致癌物通用的初筛方法之一^[24]。传统的Ames试验是采用平板掺入法，在半固体培养液中，有外源致突变物存在的情况下，组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌发生回复突变，回复为野生型，可在无组氨酸的培养基生长。故可根据菌落形成数量，检测受试物是否为致突变物。

食品及其添加剂的Ames试验通常选择TA97、TA98、TA100和TA102四种菌株，TA97和TA98可检出移码突变，TA100和TA102可检出碱基置换和移码突变^[25]，在S9存在下，TA98和TA100两种菌株对3R4F参比卷烟（图2.2）的TPM相对比较敏感^[26，27]。TA98和TA100的组合同样能检测出移码突变和碱基置换，因此，在研究CSC的致突变能力时，可采用TA98和TA100这两种菌株进行。由于不同诱变剂所需S9的浓度不同，在进行Ames试验时，每平板S9的含量，直接关系到诱变剂的最佳诱变作用。在采用体积分数5%和10%两种S9浓度进行活化后发现，两者的活化效果基本一致，因此在S9浓度选择上，以5%为佳，可以在保证试验结果有效的前提下，使Ames试验更为简便、省时和节约^[26]。而且，研究发现在标准平板掺入法的基础上增加了预培养阶段，如37℃预培养20min后，回突变菌落数普遍增加，这是由于较高温度下孵育CSC、细菌和S9，可能提高了CSC中某些遗传毒性物质敏感性。同时，随着预培养时间的增加，回复突变菌落数增长相对缓慢，可能由于长时间的孵育，引起S9的活性降低，或是长时间接触较高浓度的CSC出现抑菌现象，从而影响了CSC对细菌的致突变作用。

图2.2 3R4F参比卷烟组成示意图

Combes等^[28]采用TA98、TA100、TA102、TA1535和TA1537这5种菌株，在加和不加S9的情况下，检测参比卷烟2R4F、M4A（混合型烟，英美烟草公司做质控的卷烟，醋酸纤维滤棒）、W860（80%未处理的烟叶和20%的梗丝，醋酸纤维滤棒）、W861（80%未处理的烟叶和20%的梗丝，滤棒含40mg选择性吸附部分烟气成分的离子交换树脂和20mg活性炭）、W862（含80%的一些蛋白质和酚类物质去除的烟叶和20%的梗丝，滤棒含40mg选择性吸附部分烟气成分的离子交换树脂和20mg活性炭）、W863（含80%的一些蛋白质和酚类物质去除的烟叶和20%的梗丝，滤棒含60mg活性炭）和W864（40%混合型烟叶、40%一些蛋白质和酚类物质去除的烟叶和20%的梗丝，滤棒含60mg活性炭）等7种卷烟的致突变作用。在S9存在时，所有卷烟的CSC均引起TA98、TA100和TA1537剂量依赖的回变菌落数增加。而S9存在时，TA102和TA1535及无S9时的所有菌株均未表现出回变菌落数的增加。对于响应菌株，采用单位剂量的无烟碱干粒相物（Nicotine-Free Dry Particulate Matter，NFDPM）回变菌落数表达致突变能力。当S9存在时，通过对TA98的致突变能力的比较发现，2R4F比M4A具有更强的致突变性，W863的致突变能力最小。W860和W861表现出较高的致突变能力。在配对统计比较试验中，W862的致突变能力显著低于W861（P＜0.05）。

McAdam等^[29]对9种试验卷烟开展Ames试验，各卷烟中加入的烟草替代物质（Tobacco-Substitute Sheet，TSS）的含量不同，滤棒为醋酸纤维（Cellulose Acetate，CA）滤棒或二元碳复合（Dual Segment Carbon，DC）滤棒，各卷烟的特征分别为S618（对照烟草/CA滤棒）、S619（60% TSS/CA滤棒）、S620（30% TSS/CA滤棒）、N324（对照烟草/CA滤棒）、R817（60%TSS/CA滤棒）、S513（对照烟草/DC滤棒）、P462（60% TSS/DC滤棒）和T291（50% TSS+甘油/DC滤棒）。按照Baker等^[30]的方法，使用5种鼠伤寒沙门氏菌株：TA 98、TA 100、TA 102、TA 1535和TA 1537，在加和不加S9的情况下，研究9种卷烟烟气的TP M、NFDP M、无烟碱无保湿剂的干粒相物（Nicotine and Humectants-Free Dry Particulate Matter，NHFDPM）的致突变作用。研究发现，仅TA98、TA100和TA1537表现出阳性反应，进一步做剂量反应关系的拟合，计算各卷烟每1μg的TP M、NFDP M和NHFDP M的回变菌落数，结果发现，对于TA98和TA1537，实验卷烟的单位TPM和NFDPM回变菌落数均小于对照卷烟。除S620外，其余差异均有统计学意义。对于TA100菌株，除R817外，实验卷烟的单位TP M和NFDP M回变菌落数在统计学上未显著低于对照香烟。

Zenzen等^[31]研究7种卷烟的烟气致突变作用，样品分别是3个加热不燃烧卷烟EHCSS系列（EHCSS-K6、EHCSS-K6^M、EHCSS-K3）、M6UK（英国市场上6mg焦油的万宝路）、M6J（日本市场上6mg焦油的万宝路）、PM1（1mg焦油的菲莫1号）和Lark1（1mg焦油的云雀1号），其中M6J和Lark1为含碳滤棒。研究发现，TA102和TA1535在S9存在和不存在的情况下，8种卷烟的烟气均未表现出致突变作用。对于TA98，当S9存在时，M6UK和M6J的单位卷烟回变菌落数最大，其次为PM1、Lark1、EHCSS-K6、EHCSS-K6^M、EHCSS-K3，在不加S9时，M6UK的单位卷烟回变菌落数最大，其次为M6J、EHCSS-K6^M、EHCSS-K6、EHCSS-K3、PM1和Lark1。对于TA100，在S9存在时，M6UK和M6J的单位卷烟回变菌落数最大，其次为PM1、Lark1、EHC-SS-K6^M、EHCSS-K6、EHCSS-K3，在不加S9时，M6J的单位卷烟回变菌落数最大，其次为M6UK、EHCSS-K6、PM1、EHCSS-K6^M、EHCSS-K3、Lark1。对于TA1537，在S9存在时，M6J的单位卷烟回变菌落数最大，其次为M6UK、PM1、Lark1、EHCSS-K6^M、EHCSS-K6、EHCSS-K3，在不加S9时，M6UK的单位卷烟回变菌落数最大，其次为M6J、EHCSS-K6^M、EHCSS-K6、EHCSS-K3、PM1、Lark1。

有研究认为传统平板掺入法的Ames试验存在灵敏度低的缺点。1976年，Greeen等通过改良Ames试验发明了波动法（Fluctuation test）^[32]。1978年，Levin^[33]在其基础上做了改进，建立了微量波动法（Microtitre Fluctuation test），Hollstein和McCann认为微量波动法非常灵敏，可用于检测不到标准A-mes试验所要求浓度的1/100的诱变剂^[34]。微量波动法的原理与传统平板掺入法基本相同。微量波动法的受试对象也是采用鼠伤寒沙门氏菌突变型（组氨酸缺陷型），不同的是在微量波动法中，培养系统采用液体培养基（pH在7.2左右），在96孔细胞培养板中培养，由于细菌生长、葡萄糖的分解和酸的产生，培养液的pH就逐渐降低，此时通过细菌代谢产物导致加入的酸碱指示剂（溴甲酚紫^[1]）颜色变化，来判断细菌的生长，紫色透明为阴性，黄色浑浊为阳性。外源化合物致突变能力越强，变色的孔数越多。

军事医学科学院^[35]以TA98和TA100为受试对象，采用Ames试验微量波动法和传统掺入法检测4种CSC的致突变性，结果显示，随着CSC剂量的增加，两种方法测定的致突变性均呈剂量依赖性的增加。表明微量波动法测定的结果与传统掺入法测定的结果具有一致性，微量波动法应用于卷烟烟气的安全性评价具有一定的可靠性和实用性。而从结果中可以看出，对于致突变性相近的CSC，传统掺入法在较高剂量CSC染毒时才能显示出差别，而微量波动法在低剂量CSC染毒时就可表现出明显差异，表明微量波动法相对于传统掺入法在进行卷烟安全性评价中具有灵敏度高的特点^[34]。2007年，笔者项目组收集了市场上的163种卷烟样品，其中焦油释放量为1～5mg样品5个，占3.1%；6～10mg样品24个，占14.7%；11～13mg样品31个，占19.0%；14～15mg样品103个，占63.2%。采用Ames试验微量波动法对163种卷烟烟气的CSC进行致突变试验，以50%细菌回复突变剂量（M50）为评价指标，联合细胞毒性试验、小鼠微核试验、急性吸入毒性试验，结合卷烟烟气的29种有害成分分析数据，用遗传算法建立有害成分与毒理学指标之间量化数学模型，首次确定了对卷烟主流烟气危害性影响最大的7项有害成分指标：CO、HCN、NNK、NH₃、B [a] P、苯酚、巴豆醛^[36]。

微核（Micronucleus，MCN），也称卫星核，细胞在有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍留在细胞质中的整条染色单体或染色体的无着丝断片或环。在末期单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内面形成。存在于细胞质中独立于主核的核小体，染色与主核一致，但比主核淡，直径小于主核的1/3，是真核细胞的一种异常结构，主要因有害因素作用细胞导致的染色体丢失或断裂，是染色体畸变的一种表现形式。

目前国内对食品及其添加剂安全性评价时的微核试验主要以体内为主，多采用GB 15193.5—2014《食品安全国家标准 哺乳动物红细胞微核试验》来开展研究。随着3R原则的推广，国内外毒性测试策略的转变，当前对化合物的微核试验多采用体外微核试验（In Vitro Micronucleus Test，IVMNT），对于此实验，OECD487有详细的检测方针。

IVMNT是检测分裂期间细胞质中微核的遗传毒性试验。IVMNT是利用体外培养的人或啮齿动物细胞，检测染色体断裂剂和整倍体毒物引发的畸变。试验时可以添加或不添加肌动蛋白聚合反应抑制剂细胞松弛素B，添加细胞松弛素B有利于使细胞处于有丝分裂期，由于这些细胞都是双核的，所以在那些已经完成一个细胞分裂周期的细胞中可以鉴别和选择性分析微核率。采用多种细胞系，如CHO、V79、CHL、L5178Y及人淋巴细胞。这些细胞的IVMNT已经欧洲委员会欧盟替代方法验证中心（European Centre for Validation of Alternative Methods，ECVAM）的科学咨询委员会（Scientific Advisory Committee，SAC）认可为科学有效。也有采用人TK6细胞和HepG2细胞的IVMNT，但还需在效度研究中获得印证。

目前，国内外卷烟烟气的微核试验主要以IVMNT为主。(www.daowen.com)

Combes等^[28]以V79位研究对象，采用IVMNT检测W860、W861、W862、W863和W864 卷烟烟气粒相物（Particulate Matter，PM）的遗传毒性。在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中培养V79细胞，用试验或对照样品振荡培养3h，然后用S9处理17h，或在不加S9的情况下培养20h。每个PM至少有6个剂量，微核结果参考OECD487，对不同剂量的微核双核（Micronucleated Binucleated，MnBn）细胞与溶剂对照进行配对t检验。研究结果发现，所有的PMs均有遗传毒性。PMs可使MnBn的微核率提高3倍以上，在剂量和%MnBn/μg NFDPM上，不加S9的20h处理比3h处理更敏感。在不加S9的20h，W862诱发的微核率比W860和W861小。在3h染毒中，加和不加S9，W862诱发的微核率小于W861。

采用3R4F参比卷烟开展CSC和全烟气暴露的体外微核研究，并对微核率与烟气剂量之间的关系进行回归分析，拟合线性回归方程。由于CSC染毒与全烟气暴露实验测试指标的单位不同，CSC染毒实验的烟气剂量单位一般为“μg/mL CSC”，而全烟气暴露实验的烟气剂量单位一般为“烟气百分比”，因此二者的结果之间无法直接比较。为了达到比较的目的，假设进入到暴露装置的卷烟主流烟气中的CSC被暴露装置内培养液完全吸收，则可将以“烟气百分比”为单位的烟气剂量换算为以“μg/mL CSC”为单位的数值，研究发现，全烟气暴露与CSC染毒方式测试结果的线性方程斜率分别为1.086和0.226。由此可见，在相同烟气剂量下，采用全烟气暴露方式测试的卷烟主流烟气遗传毒性大于CSC染毒的测试结果。

对卷烟烟气有害成分NNK和AαC的CHO细胞体外微核试验发现，与阴性对照[微核率为（1.50 ± 0.22）%] 相比，NNK剂量大于50μg/mL时微核率显著增加（P＜0.05）。在染毒剂量大于 100μg/mL[微核率为（4.01 ±0.88）%] 时，微核率较大幅度增加，在最大染毒剂量400μg/mL时微核率为（14.67±1.08）%。AαC剂量大于20μg/mL时微核率显著增加（P＜0.05）。在染毒剂量大于20μg/mL[微核率为（5.88 ± 1.15）%] 时，微核率较大幅度增加，在最大染毒剂量40μg/mL时微核率为（10.67±1.82）%。

目前国内外对卷烟烟气的危害评价主要以CORESTA烟草烟气体外毒性测试工作组推荐的细胞毒性试验^[37]、Ames试验^[38]和体外微核试验^[39]为主。而卷烟烟气中的有害成分包括多种遗传毒性化合物如多环芳烃、TSNAs等，导致的遗传学终点也有所不同，仅仅采用Ames试验和体外微核试验并不足以全面评价卷烟烟气的遗传毒性，而且与食品添加剂、食品接触材料用物质、药物等遗传毒性检测的试验组合有一定的差距。

小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验是Clive和Spector于1975年创建的方法，利用突变细胞对嘧啶类似物表现出抗性而存活的特点对TK-突变体进行选择，从而检测化学物或其他环境因素的诱变性^[40]，是具有检出灵敏度较高、检测谱较广，且简便易行的体外短期致突变试验方法^[41]。随着TK基因突变试验实验技术的不断完善，欧盟、美国都将其作为食品添加剂和食品接触材料用物质必选的遗传毒性试验之一。此后，中国也开展了TK基因突变试验方法的推广，在修订和新发布的保健食品、药品、化妆品等安全性毒理学评价程序中，也已将其列为必选或备选的遗传毒性试验之一。

鉴于TK基因突变试验拥有众多优点，国内外陆续开展了卷烟烟气的TK基因突变实验研究。采用ISO 4387抽吸方法（抽吸容量35mL，每口抽吸2s，每30s抽吸一口）于转盘吸烟机抽吸3R4F参比卷烟20支，抽吸结束后，用DMSO以10mg/mL萃取滤片上的CSC，在加S9的情况下，80μg/mL的突变频率是溶剂对照组的3倍以上，实验结果呈现阳性^[42]。Scott等^[43]检测TPM的体外遗传毒性强度，并对Ames试验、体外微核试验和小鼠淋巴瘤试验（mouse lymphoma assay，MLA）进行统一的统计分析。采用斜率、固定效应和单剂量比较的分级决策过程，解决了TP M遗传毒性的30%差异。

美国FDA^[44]的研究人员采用MLA的微平板法和软琼脂法对11例CSCs的致突变性进行了研究。这些CSCs是从商业或实验卷烟中制备的，其中10种是使用ISO标准条件抽吸获得的，一种是根据马萨诸塞州公共卫生部（Massa-chusetts Department of Public Health，MDPH）的深度抽吸条件（抽吸容量45mL，每口抽吸2s，每30s抽吸一口，50%通风口堵塞）获得。在大鼠肝脏S9存在的情况下，用11种不同浓度（25～200mg/mL）的CSCs处理L5178Y/TK^+/-小鼠淋巴瘤细胞4h，所有CSCs均呈剂量依赖性增加MLA的细胞毒性和致突变性。用剂量-反应曲线线性回归的斜率计算了CSCs的抗性突变频率，并以每微克CSC的抗性突变频率表示CSCs的致突变强度，研究发现，致突变强度与卷烟焦油释放量或烟碱浓度无相关性。用两种不同的吸烟条件对同一种商业卷烟抽吸获得的两种CSCs进行比较，结果表明，在每微克CSC的基础上，ISO条件下产生的CSCs比在MDPH条件下产生的CSCs具有更强的致突变性。并且研究了11个CSCs诱导的突变体在跨越整个11号染色体的4个微卫星位点上的杂合性丢失（Loss of Heterozygosity，LOH）。最常见的突变类型是LOH，染色体损伤范围小于34mbp。这些结果表明MLA在不同的CSCs中可识别出不同的遗传毒性能力，并且这两种方法的结果是相似的。

Cobb RR等^[45]开展了卷烟的主流烟气和侧流烟气冷凝物的TK基因突变试验，以小鼠淋巴瘤L5178Y TK+/——3.7.2C细胞为受试对象，烟气的三氟胸苷抗性突变频率与阴性对照有显著性差异，并表现出剂量-反应关系，显示有遗传毒性。Roemer E等^[46]在1R4F和8种市售卷烟的卷烟纸上添加磷酸铵镁，采用电加热方式，比较添加磷酸铵镁和未添加磷酸铵镁的烟气毒性差异，结果显示，卷烟纸上添加磷酸铵镁的卷烟比未添加的卷烟的烟气细胞毒性和遗传毒性（Ames试验和TK基因突变试验）均有明显降低。

除了Ames试验、体外微核试验和TK基因突变试验，对卷烟烟气的遗传毒性研究还有彗星试验、体外检测γH2AX试验等。

Dalrymple等^[47]利用彗星试验检测了3R4F的TPM对肺泡II型细胞的遗传毒性，结果显示3R4F的TPM可以引起肺泡II型细胞DNA损伤，且随着暴露时间的延长显著增加。Messner等^[14]利用彗星试验检测了CSC对HUVEC细胞的DNA损伤，结果显示CSC可以导致DNA链断裂，诱导p53激活并影响线粒体膜电位。Kim等^[48]利用体外微核试验（CHO-K1细胞）、Ames试验（鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA1537）、彗星试验对韩国两种卷烟TL和TW和3R4F参比卷烟的CSC遗传毒性作了评价，结果显示TL和TW与3R4F参比卷烟的CSC均可引起显著的微核形成，TA98和TA1537诱变以及DNA损伤，具有致突变性和遗传毒性。陆叶珍等^[49]利用彗星试验、微核试验和TCR基因突变试验检测了卷烟CSC遗传毒性，结果显示CSC加S9与不加S9两个处理组均能诱发人外周血淋巴细胞发生DNA损伤、微核和TCR基因突变率升高。

以卷烟烟气有害成分NNK和2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b] 吲哚开展遗传毒性研究，检测γH2AX焦点率，γH2AX焦点与DNA双链断裂数量存在一一对应关系，被认为是检测细胞DNA双链断裂的特异性指标^[50]。研究发现，随着NNK染毒剂量的增加，γH2AX焦点率增加，与阴性对照[γH2AX焦点率为（1.98±0.15）%] 相比，NNK剂量大于25μg/mL时，γH2AX焦点率显著增加（P＜0.05），在最大染毒剂量400μg/mL时γH2AX焦点率为（4.34 ± 0.20）%；随着AαC染毒剂量的增加，γH2AX焦点率也呈增加趋势。与阴性对照[γH2AX焦点率为（3.81±0.15）%] 相比，AαC剂量大于10μg/mL时γH2AX焦点率显著增加（P＜0.05）。研究基于CHO细胞采用两种高通量的组合实验，分别从DNA和染色体水平，综合评价NNK和AαC的遗传毒性，结果显示两种物质均具有潜在的遗传毒性，与流式微核方法相比，流式γH2AX方法缩短了检测周期，提高了检测效率，流式γH2AX方法灵敏度更高。