细胞毒性试验是以原代培养的细胞或是从感兴趣的靶器官取出并建立的细胞系为基础的。细胞毒性是化合物引起细胞死亡的能力的最初表现。一般以细胞毒性数据作为急性系统毒性的指标。目前，已有相当多的研究用细胞毒性数据预测体内急性毒性。

细胞毒性是化合物作用于细胞基本结构和（或）生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞新陈代谢，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱，所引发的不良反应^[6]。细胞毒性按作用机制分为三种类型：①基本细胞毒性，涉及一种或多种上述结构或功能的改变，作用于所有类型的细胞；②选择细胞毒性，存在于某些分化细胞上，主要通过化合物的生物转化，与特殊受体结合或特殊的摄入机制所引发；③细胞特殊功能毒性，对细胞结构和功能损伤轻微，但对整个机体损伤非常严重。

美国国立职业安全与卫生研究所（National Institute for Occupational Safety and Health，NIOSH）开展了体外细胞毒性和急性毒性之间的定量研究，其化合物毒性作用数据库（Registry of Cytotoxicity，RC）对多种化合物的体外细胞毒性的半数抑制浓度（IC₅₀）及经口和静脉注射的急性毒性半数致死剂量（LD₅₀）值进行线性回归分析比较，获得RC预测模型，用于急性毒性LD₅₀值的预测^[7]。RC方法具有广泛的实用价值，例如，它可以应用于制药业或化学工业，用于监管测试或研究。用RC法，可以在预定的剂量范围内，预测347种外来药物中252种的急性口服LD₅₀，150种外来药物中的117种，大鼠和/或小鼠静脉注射LD₅₀。比较研究表明，这些结果具有较高的重现性。体外方法有助于预测化合物急性暴露引发的全身和局部影响，并评估体内毒性剂量。因此，进行急性毒性检测前首先进行体外细胞毒性分析，然后根据RC预测模型进行LD₅₀值预测，选择体内急性毒性最适宜的开始剂量，可以减少实验动物的使用。

卷烟烟气的细胞毒性检测方法较多，通常以永生化细胞和转化细胞为受试对象，检测方法包括：台盼蓝染料排斥法评估细胞活力、中性红染色观察溶酶体、测定四唑盐（如MTT、XTT等）还原为甲臜（Formazan）的量以评估线粒体活力、LDH释放量以评估细胞膜完整性等。

（1）染料排斥法细胞损伤或死亡时，某些染料，如台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等，可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止这类染料进入细胞里。由此，鉴别死细胞和活细胞，通过镜下观察，按以下公式计算活细胞率^[8]。

（2）染料摄入法 中性红染料可以被活细胞摄入，并在溶酶体中积累。细胞增殖越快，细胞数量越多，摄入的中性红的量也越多，细胞受到损伤时，中性红的摄入能力下降。使用酶标仪检测细胞培养板每孔中性红提取液在540nm波长处的吸光值。半数抑制浓度（IC₅₀）的计算使用Calcusyn 2.0软件。

以台盼蓝染色法评价CSC的细胞毒性的研究较少，大多是利用中性红染色法来评价CSC的细胞毒性。Cervellati等^[9]以源于皮肤和肺部的细胞，即角朊细胞HaCaT和A549为受试对象，采用台盼蓝染色方法检测英国某实验卷烟（烟碱释放量1.1mg/支烟、焦油释放量12mg/支烟）的细胞毒性，台盼蓝染色后，细胞计数器计数活细胞和死细胞，计数3次，以平均值分析，对照组HaCaT和A549的细胞存活率24h内无明显变化，而CSC在染毒的前期（6h），细胞存活率开始下降。

研究采用中性红摄入法对ISO标准抽吸方案和HCI深度抽吸方案的CSC进行中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary，CHO）细胞的细胞毒性试验，研究发现，深度抽吸条件的细胞毒性小于标准抽吸条件^[10]。而后在研究中发现，卷烟的接装纸透气度和滤棒吸阻对细胞毒性会产生影响，以不同透气度接装纸卷烟样品和不同吸阻滤棒卷烟样品的CSC为受试物，对CHO细胞染毒，随着接装纸透气度的增加，CSC的IC₅₀值逐渐增大，表明随着接装纸透气度的增加，CSC的细胞毒性逐渐降低；随着滤棒吸阻的增加，CSC的IC₅₀值逐渐增大，表明随着滤棒吸阻的增加，CSC的细胞毒性逐渐降低。而且CSC的细胞毒性与CO、NNK、NH₃、HCN、B [a] P、巴豆醛和苯酚7种烟气有害成分的释放量之间具有一定的相关性^[11]。

Richter等对2R4F参比卷烟、美国市售不含薄荷的“淡”卷烟LT和LT-MAS、美国市售不含薄荷的全味卷烟FF、100%烟草薄片的实验卷烟REC、100%烤烟实验的实验卷烟BRI、100%白肋烟的试验卷烟BUR和美国市售不含薄荷的活性炭过滤卷烟CHAR等8种卷烟的CSC染毒BALB/c-3T3细胞和中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，采用中性红摄入法检测细胞毒性作用。对于BALB/c-3T3细胞，2R4F的CSC在剂量50μg/mL及以上对细胞呈轻微（不超过20%的细胞呈圆形，松散附着，无胞浆内颗粒，偶见溶解细胞）到轻度的（不超过50%的细胞呈圆形，无胞浆内颗粒，无广泛的细胞溶解和细胞间空区）细胞毒性，LT、LTMAS和REC的CSC剂量分别在100和200μg/mL时，表现出轻微和轻度的细胞毒性。FF的CSC在100和200μg/mL时具有轻微和中度的细胞毒性（不超过70%的细胞层，含有圆形细胞或溶解细胞）。BUR的CSC在50μg/mL及以上时表现出轻度至中度的细胞毒性。CHAR的CSC在100和200μg/mL时产生轻度和中度细胞毒性。BRI的CSC细胞毒性最大，在50μg/mL及以上时表现为轻度至重度（几乎完全破坏细胞层）。8种卷烟对BALB/c-3T3细胞的毒性大小排序：BRI＞BUR＞CHAR＞FF＞2R4F＞LT、LTMAS和REC。对于CHO细胞，2R4F、LT和BUR的CSC在100和200μg/mL时表现出轻微的细胞毒性。LTMAS和FF的CSC在50和100μg/mL时毒性较小，而LTMAS在200μg/mL时毒性较小，FF具有中等的细胞毒性。REC和CHAR的最高剂量仅为轻度细胞毒性。BRI的CSC在100μg/mL时有轻度的细胞毒性，在200μg/mL时具有较强的细胞毒性，8种卷烟对CHO细胞的毒性大小排序：BRI＞FF＞LTMAS＞2R4F、LT和BUR＞REC和CHAR。此外，对反应性评分的分层RIDIT Fliss分析表明，CHO细胞的CSCs评分与BALB/c-3T3中的CSCs评分有显著性差异（P＜0.01）。

Lou等^[12]以B细胞淋巴母细胞株HMy 2.CIR为研究对象，中国杭州市场上12种市售卷烟的CSC为受试物，焦油释放量的范围为3～15mg/支，ISO标准抽吸方式收集CSC，采用中性红摄入法进行细胞毒性试验，结果发现，除了4号卷烟（焦油释放量3mg/支），其他卷烟的CSC均对HMy 2.CIR表现出细胞毒性作用，11种卷烟的细胞毒性也有所差异，与DMSO相比，1号（焦油释放量15mg/支）、5号（焦油释放量15mg/支）、6号（焦油释放量15mg/支）、9号（焦油释放量12mg/支）、10号（焦油释放量14mg/支）、11号（焦油释放量15mg/支）和12号（焦油释放量15mg/支）卷烟样品在剂量为2.5 × 10^-3～12.5 × 10^-3支烟/mL时，细胞存活率有明显下降，7号（焦油释放量7mg/支）和8号（焦油释放量8mg/支）在剂量7.5×10^-3～12.5×10^-3支烟/mL时，细胞存活率有明显下降，2号（焦油释放量8mg/支）和3号（焦油释放量5mg/支）样品在剂量为10.0 × 10^-3～12.5 × 10^-3支烟/mL时，细胞存活率有明显下降，并且，第10号卷烟的CSC细胞毒性最强。

以线粒体酶活性来判断细胞毒性的检测方法主要有MTT和XTT。(www.daowen.com)

（1）MTT四唑盐比色试验所用的显色剂是3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）。MTT比色试验的原理是，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶水性的蓝紫色结晶甲臜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm或540nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数呈正比。该方法不仅用于细胞毒性试验，也已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选以及肿瘤放射敏感性等。

（2）XTT MTT比色试验具有简便、快速、灵敏等优点，但是，MTT经还原产生的甲臜不溶于水，需溶解后才能检测，无疑增加了工作量，对实验结果也产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。因此，出现了以XTT（二甲氧唑黄）进行检测的毒性测试方法。XTT是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，活细胞线粒体中存在与辅酶Ⅱ相关的脱氢酶，可将黄色的XTT还原成水溶性的橘黄色的甲臜。生成的甲臜能够溶解在组织培养基中，不形成颗粒，可直接用酶联免疫检测仪测定吸光值。

Richter等^[13]以人肺微血管内皮细胞（Human microvascular endothelial cells from the lungs，HMVEC-L）、正常人支气管上皮细胞（normal human bronchial epithelial cells，NHBE）和人小气道上皮细胞（Human Small Airway Epithelial Cells，SAEC）进行共培养，对 8种卷烟进行MTT细胞毒性试验。根据对MVEC-L、NHBE和SAEC细胞的形态学观察，在人肝微粒体酶S9存在时，8种卷烟的CSC均有明显的细胞毒性作用，在无S9时，NHBE、SAEC和MVEC-L细胞暴露于CSC后，细胞的存活率下降。低剂量的2R4F、LT、LT-MAS和FF对SAEC有促进作用，表现为细胞活力增强。低剂量的2R4F、LT、LTMAS、FF、REC和CHR对MVEC-L中的细胞活力也有所提高。除BRI外，BUR和CHAR暴露后的NHBE细胞存活率下降1.5倍，2R4F暴露后的NHBE细胞存活率下降至5.6倍。BRI卷烟的卷烟烟气冷凝物对NHBE细胞的毒性最强，BRI的所有试验剂量将细胞存活率降低到不超过49%。BRI的EC₅₀为15μg/mL。2R4F、LT、LTMAS、FF和REC的EC₅₀在92～132μg/mL。BUR和CHAR的EC₅₀大于200μg/mL。对于SAEC，CSCs引起细胞活力下降幅度在1.3倍（REC）和17倍（2R4F）之间。BRI的CSC对SAEC细胞毒性最大，EC₅₀为46μg/mL。2R4F、LTMAS和FF（EC₅₀为128～170μg/mL）均有中度细胞毒性。LT、REC、BUR和CHAR的CSC的细胞毒性最低（EC₅₀大于 200μg/mL）。8种卷烟的CSC对MVEC的相对存活率下降范围为1.5倍（BUR）至18倍（LT）。BRI的CSC对MCEC-L细胞的细胞毒性最大，EC₅₀为32μg/mL。2R4F、LT、LTMAS和FF的卷烟烟气冷凝物EC₅₀为125～160μg/mL。缩合物REC、BUR和CHAR的CSC的EC₅₀均大于200μg/mL。

Messner等^[14]以人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）为研究对象，采用某种卷烟的CSC进行染毒，基于XTT的分析显示，与对照组相比，50和100mg/mL的CSC可显著减少存活细胞的数量。

细胞质LDH的释放通常是细胞膜损伤的指示物。LDH的释放近年来用于CSC和新型烟草制品的细胞毒性检测。LDH是活细胞胞浆内含酶之一。在正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到有害物质攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中，释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I（NAD⁺）变成还原型辅酶I（NADH/H⁺），后者和INT（2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride）在硫辛酰胺脱氢酶（diaphorase）催化反应生成NAD⁺和有色甲臜类化合物，在490nm或570nm波长处产生吸收峰，吸光度与LDH活性呈线性正相关，从而通过比色来定量LDH的活性。

Messner等^[14]以LDH酶活性方法对CSC处理的HUVEC的LDH释放进行分析，50μg/mL的CSC对细胞膜完整性无影响，而100μg/mL的CSC孵育48h后，LDH大量释放。Cervellati等^[15]以HaCaT和A549为受试对象，采用LDH释放量方法检测英国某实验卷烟的细胞毒性，按照试剂盒的指示测定和计算培养液中LDH的含量。在每种试验前，用2%（体积分数）TritonX-100在37℃培养30min，以100%毒性为阳性对照，分别进行3次试验，得到具有代表性的最大LDH释放量。对照组HaCaT和A549的细胞存活率24h内无明显变化，且LDH的释放稳定在低水平，而CSC在染毒的前期（6h），LDH的释放开始增加。

Richter等^[13]也利用LDH法检测CSC的细胞毒性作用，研究发现，50μg/mL时，膜完整性无变化，100μg/mL时，LDH的释放量增加，而且是在染毒48h后开始出现LDH的增加。

Cavallo等^[16]将无过滤嘴卷烟A（焦油释放量10mg/支烟、烟碱释放量0.8mg/支烟、CO释放量8mg/支烟）和卷烟B（焦油释放量10mg/支烟、烟碱0.9mg/支烟、CO释放量 7mg/支烟），市售过滤嘴卷烟C（焦油释放量9mg/支烟、烟碱0.8mg/支烟、CO释放量8mg/支烟）和卷烟D（焦油释放量9mg/支烟、烟碱 0.7mg/支烟、CO释放量 9mg/支烟）4种卷烟的CSC，对A549和支气管上皮细胞Beas-2B染毒。对于A549细胞，卷烟A CSC的剂量在1.25%和5%时，卷烟B CSC剂量为5% CSE时，均未见细胞膜损伤；卷烟A CSC染毒在10%、卷烟B CSC染毒剂量为10%时，LDH释放量的增加，卷烟D CSC染毒的A549在剂量范围内未出现LDH释放量的增加，对于Beas-2B细胞，卷烟A CSC的剂量在1.25%和5%时，卷烟B CSC剂量为5% CSE时，也均未见细胞膜损伤，卷烟B CSC剂量为10% LDH的释放均明显高于对照组，卷烟A和卷烟C的剂量组均未出现LDH的增加。

CCK-8试剂中含有WST-8，化学名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下，被细胞线粒体中的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖呈正比，与细胞毒性呈反比。使用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值OD，可间接反映活细胞数量。

Lou等^[17]采用CCK-8方法比较市售的1号卷烟（焦油释放量3mg/支烟、烟碱0.3mg/支烟、CO释放量3mg/支烟）和2号卷烟（焦油释放量15mg/支烟、烟碱1.3mg/支烟、CO释放量15mg/支烟）的细胞毒性差异，剂量均为2.5 × 10^-3支烟/mL、5.0 × 10^-3支烟/mL、7.5 × 10^-3支烟/mL、10.0 × 10^-3支烟/mL和12.5 × 10^-3支烟/mL，在试验剂量条件下，1号卷烟的活细胞比例为83.84%～91.04%，2号卷烟的活细胞比例为 12.28%～90.2%，与对照组DMSO相比，1号卷烟在剂量为10.0 × 10^-3支烟/mL、12.5 × 10^-3支烟/mL时，2号卷烟在5.0×10^-3～12.5×10^-3支烟/mL时，活细胞比例下降显著（P＜0.05）。在相同剂量下，1号卷烟与2号卷烟的活细胞比例比较，2号卷烟在5.50 × 10^-3～12.5×10^-3支烟/mL剂量下的活细胞数均显著低于1号卷烟（P＜0.01）。