【重点内容】

样品前处理、软件操作（方法建立、图谱处理）、定性定量分析数据处理。

【教学目标】

1．知识目标

熟悉动物性食品中氟喹诺酮类药物残留的特点及残留量标准，了解动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测国家标准要求。

2．技能目标

掌握高效液相色谱法测肉品中氟喹诺酮类药物残留量，并能对试验误差进行有效分析。

资 料 单

氟喹诺酮类药物是一类人工合成的广谱抗菌药，其开发始于20世纪80年代。氟喹诺酮类药物具有广谱抗菌、抗菌作用强、体内分布广泛、组织药物浓度高、蛋白结合率低、使用方便、不良反应小及价格低等特点，20余年来，它已成为发展最快的化学合成抗菌药物，在临床上广泛用于动物和人类的各种感染性疾病的治疗。随着在食品动物的广泛应用，其残留问题引起了人们的广泛关注。氟喹诺酮类药物残留不但对人体有直接的危害，更为严重的是，致病菌对其耐药性正逐渐增强，从而不利于该药物治疗人类相关疾病。目前已发现某些氟喹诺酮类药物具有潜在致癌性。各国政府对氟喹诺酮类药物残留检测的研究都非常重视，各种分析方法得以发展和应用，主要有微生物法、色谱法、免疫分析法等氟喹诺酮类药物。在动物食品中的残留应选择特异性强、灵敏度高、高效快速的检测方法，其中微生物检测方法，检测限过高，特异性不强，不够灵敏，适合于快速筛选，液相色谱法具有高效、快速、灵敏、准确等特点，是目前应用最多的一种方法。液相色谱法前处理较复杂。液相色谱质谱法所用仪器要求高，价格高，适用于残留药物的确证。免疫分析方法灵敏度高，特异性比微生物法强，单抗的特异性更高，可适用于大量样品的快速筛选及某一样品的确证。

技 能 单

动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测采用高效液相色谱法。

一、原理

用磷酸盐缓冲溶液提取饲料中的药物，C18柱净化，流动相洗脱。以磷酸三乙胺为流动相，用高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量。

二、试剂

所用均为分析纯试剂，水为二级水。

达氟沙星：含量不得少于99%；诺氟沙星：含量不得少于99%；环丙沙星：含量不得少于99%；沙拉沙星：含量不得少于99%；磷酸；氢氧化钠；乙腈：色谱纯；甲醇；三乙胺；磷酸二氢钾；5.0 mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠饱和溶液28 mL，加水稀释至100 mL；0.03 mol/L氢氧化钠溶液：取5.0 mol/L氢氧化钠溶液0.6 mL，加水稀释至100 mL；0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液：取浓磷酸3.4 mL，用水稀释至1 000 mL，用三乙胺调pH值至2.4。

磷酸盐缓冲溶液（用于肌肉脂肪组织）：取磷酸二氢钾6.8 g，加水溶解，并稀释至500 mL。用5.0 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0。

磷酸盐缓冲溶液（用于肝脏、肾脏组织）：取磷酸二氢钾6.8 g，加水溶解，并稀释至500 mL，pH值为4.0～5.0。

达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星标准储备液：分别取达氟沙星对照品约100 mg，恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星对照品各约50 mg，精密称定，用0.03 mol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释成浓度为0.2 mg/mL（达氟沙星）和1 mg/mL（恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星）的标准储备液，置于2 ℃～8 ℃冰箱保存，有效期为3个月。

达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星标准工作液，准确量取适量标准储备液用乙腈稀释成适宜浓度的达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星标准工作液，置于2 ℃～ 8 ℃冰箱保存，有效期为1周。

三、仪器与材料

高效液相色谱仪（配荧光检测器）、天平（感量0.01 g）、分析天平（感量0.000 01 g）、振荡器、组织匀浆机、离心机、匀浆杯（30 mL）、离心管（50 mL）、固相萃取柱（C18 100 mg/mL）、微孔滤膜（0.45 μm）。

四、方法与步骤

（一）制样

样品的制备：取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎并使均匀。

样品的保存：置于-20 ℃以下，冰箱中储存备用。

（二）试料的制备

饲料的制备，包括取绞碎后的供试样品作为供试试料，取绞碎后的空白样品作为空白试料，取绞碎后空白样品添加适宜浓度的对照溶液作为空白添加试料。

（三）样品处理

1．提取

取（2±0.05）g试料，置于30 mL匀浆杯，加磷酸盐缓冲溶液10.0 mL，以10 000 r/min匀浆2 min。匀浆液转入离心管，中速振荡5 min，离心（肌肉、脂肪10 000 r/min 5 min；肝、肾15 000 r/min 10 min），取上清液待用。用磷酸盐缓冲溶液10.0 mL，洗刀头及匀浆杯，转入离心管洗残渣，混匀，中速振荡5 min离心（肌肉、脂肪10 000 r/min 5 min；肝、肾15 000 r/min 10 min），合并两次上清液，混匀、备用。

2．净化

固相萃取柱先依次用甲醇、磷酸盐缓冲溶液各2 mL预洗，取上清液5 mL过柱，用水 2 mL，淋洗，挤干，用流动相1.0 mL，洗脱，挤干，收集洗脱液，经滤膜过滤后作为试样溶液，供高效液相色谱测定。

（四）高效液相色谱测定

1．色谱条件

色谱柱：C18 250 mm×4.6 mm（直径），粒径5 μm，或相当者。

流动相：0.05 mol/L磷酸溶液/三乙胺-乙腈（82∶18，V/V），使用前经微孔滤膜过滤。

流速：0.8 mL/min。

检测波长：激发波长280 nm；发射波长450 nm。(www.daowen.com)

柱温：室温。

进样量：20 μL。

2．标准曲线的制备

准确量取适量达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星标准工作液，用流动相稀释成浓度分别为0.005 μg/mL、0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.3 μg/mL、0.5 μg/mL的对照溶液，供色谱分析。

3．测定法

取试样溶液和相应的对照溶液，做单点或多点校准，按外标法以峰面积计算。对照溶液及试样中达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，对照溶液和试样溶液的高效液相色谱图，分别如图5-13、图5-14所示。

图5-13　氟喹诺酮类药物对照溶液色谱图

1—环丙沙星；2—达氟沙星；3—恩诺沙星；4—沙拉沙星　
（农业部1025号公告-14-2008）

图5-14　猪肝脏组织中氟喹诺酮类药物色谱图

1—环丙沙星；2—达氟沙星；3—恩诺沙星；4—沙拉沙星　
（农业部1025号公告-14-2008）

4．空白试验

除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

5．结果计算和表述

按下式计算试料中达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星的残留量。

式中　X——试料中达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星或沙拉沙星的残留量（μg/g）；

A——试样溶液中相应药物的峰面积；

AS——对照溶液中相应药物的峰面积；

　CS——对照溶液中相应药物的浓度（μg/mL）；

V1——提取用磷酸盐缓冲溶液的总体积（mL）；

V2——过C18固相萃取柱所用备用液体积（mL）；

V3——洗脱用流动相体积（mL）；

M——供试试料的质量（g）。

注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。

6．检测方法灵敏度、准确度、精密度

（1）灵敏度：达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星在鸡和猪的肌肉、脂肪、肝脏及肾脏组织中的检测限为20　μg/kg。

（2）准确度：本方法在20～500 μg/kg范围，添加浓度的回收率为60%～100%。

（3）精密度：本方法的批内变异系数≤15%，批间变异系数＜20%。

作 业 单

根据试验操作方法及要求写出被检样检验分析报告。

评 估 单

【评估内容】

【评估方法】

以操作过程是否规范为主，评价动手操作能力。

备注：项目二十九学习情境占模块五总分的30%。