【基本概念】

抗原、抗体、色谱峰、保留时间、保留因子、分离因子、质谱技术、质谱

【重点内容】

ELISA方法的原理；色谱分析法基本概念、高效液相色谱-质谱联用仪器的组成、高效液相色谱-质谱联用技术原理。

【教学目标】

1．了解兽药残留常用的测定方法。

2．熟悉免疫测定的基本概念、常规免疫测定法的应用。

3．熟悉色谱分析法的基本概念、原理，高效液相色谱法的应用特点，初步学会使用高效液相色谱仪。

4．了解高效液相色谱-质谱联用法基本概念、原理、高效液相色谱-质谱联用法的应用特点。

资料单一　兽药残留测定方法

动物性食品中兽药残留的检测技术有生物法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法、薄层色谱法、免疫分析法、高效毛细管电泳法、生物传感器法。

一、生物法

生物法是根据对抗生素敏感的试验菌，在适当条件下所产生的抑菌圈大小和药物浓度成比例的关系设计而成，是目前公认而又广泛应用的测定四环素类抗生素残留的经典方法，也是我国药典中常用的方法，使用范围广，可一次测定同类型抗生素的总效价，无须分离纯化，虽然原理及操作简单，但是所需时间长，易受其他抗生素的干扰，灵敏度不高，缺乏专一性和精确度。

二、液相色谱法

液相色谱是一种能够把液体混合物中的不同组分根据在色谱柱中保留时间进行分离、检测及收集的仪器。高效液相色谱法是目前广泛应用的一种理化检测方法，它在气相色谱理论的基础上，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分离速度快、效率高和操作自动化，大大缩短了分析时间。高效液相色谱技术主要用于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大的有机物的分离检测，是抗生素分析中最常用的方法。

三、液相色谱-质谱联用法

液相色谱-质谱联用法是当代重要的分离分析方法之一，最早用于食品中四环素残留检测。这种技术是将高分离能力、使用范围广的液相色谱分离技术（包括高效毛细管电泳、毛细管高效液相色谱）与高灵敏、高专属的质谱技术结合起来，通过对样品离子质量和强度的测定进行的定性、定量分析。它综合了液相色谱的高分离效能和质谱的高选择性、高灵敏度及丰富的结构信息，可以检测多种样品，已经成为强有力的分析工具，应用于药学研究的各个领域。超高效液相色谱串联质谱具有灵敏度高、进样量少、基质干扰小等显著优点，在兽药残留检测方面已成为国内外较为先进且积极推广使用的检测方法。

四、气相色谱-质谱联用法

气相色谱-质谱联用法是将气相色谱与质谱直接联机，气相色谱仪和气相色谱质谱接口相当于质谱的进样系统，质谱仪作为气相色谱的检测器。气相色谱质谱联用利用了气相色谱的分离能力将混合物中的组分分离，并通过接口将各个组分依次送入质谱仪的离子源中进行离子化，经过质量分析器按质荷比（m/z）进行分离后，这些离子被离子检测器检测，检测信号被计算机系统处理后获得待测组分的质谱图，计算机将待测组分的质谱图与计算机中保存的已知化合物标准质谱图按一定程序进行比较，将匹配度最高的若干个化合物的名称、分子量、分子式、识别代号及匹配率等数据列出供用户参考，进行未知化合物的鉴别。值得注意的是，匹配率最高的并不一定是最终确定的结果，还需结合各个方面进行综合分析。通用的GC-MS主要构成包括气相色谱单元、接口单元、质谱单元和计算机控制系统单元。气相色谱-质谱联用法主要采用电子轰击源和负离子化学源，灵敏度高，检出限可达0.1 μg/kg。由于氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考在硅烷化后均有几个丰度较大的碎片离子易于定性鉴别，因此气相色谱-质谱联用法是检测胺苯醇类药物残留的灵敏方法。

五、薄层色谱法

薄层色谱法（TLC）是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片，成一均匀薄层。待点样展开后，根据比移值与适宜的对照物按同方法所得的色谱图的比移值做对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种重要的试验技术，也用于跟踪反应进程，是一种微量快速而简单的色谱法。它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，具有简便快速、不需要复杂仪器等优点，已广泛应用于四环素类抗生素混合物的快速定性鉴定，但是该方法分离度、灵敏度均比高效液相色谱法差，薄层色谱法适用于挥发性较小或在较高温度条件下易发生变化的兽药分析。

六、免疫分析法

免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，包括放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等，具有操作简便、灵敏度高、专一性强、适用于批量样品分析的特点，广泛用于牛奶、动物组织、蜂蜜等动物源食品中四环素类抗生素残留的检测。与常规理化分析技术相比，免疫分析法具有特异性强、灵敏度高、检测限可达1 μg～1 pg、方便快捷、分析容量大、分析成本相对较低及安全可靠等优点。

七、高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳法是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离方法。离子的淌度是指某种离子在一定的溶剂中，当电位梯度为每米1 V时的迁移速率称为此种离子的淌度。高效毛细管电泳法与常用的液相色谱法相比，它没有高压泵，不受运行缓冲液的酸碱性和其中的表面活性剂等添加剂的影响，具有溶剂和试样消耗少、分离速度快、分离效率高、适用范围广、选择性强、仪器成本低等特点。

八、生物传感器法

生物传感器是一种由生物敏感部件与转换器紧密结合，对特定的化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆性响应的装置，包括酶传感器、组织传感器、微生物传感器等。与传统的检测方法相比，生物传感器法具有选择信号灵敏度高、响应快、易于操作、高通量及适合现场检测等优点。生物传感器在国内食品分析领域的应用比较广泛。将生物传感器与免疫分析结合，可用于检测牛奶中的青霉素类抗生素。

兽药残留检测方法不断更新完善，正向着快速、灵敏、准确、高效的方向发展。

资料单二　免疫测定技术

抗原与抗体结合反应是体液免疫的基础，也是一切免疫测定技术的最基本原理，在抗原与抗体结合反应的基础上结合生化或理化方法作为信号显示或放大系统即可建立免疫测定方法。成功的免疫测定方法必须具备性能优良的抗体、灵敏和专一性的标记物、高效的分离手段三个要素。

一、免疫测定方法分类

免疫测定方法按照是否使用标记物，可分为非标记免疫测定法和标记免疫测定法。非标记免疫测定法又称经典免疫测定法。按照标记物种类，标记免疫测定法又可分为放射性标记免疫测定法和非放射性标记免疫测定法。免疫测定方法分类见表5-5。

表5-5　 免疫测定方法分类

经典免疫测定法灵敏度较低，在残留分析中极少应用。放射性标记免疫测定法因辐射污染等问题已被淘汰。目前应用最多的是非放射性标记免疫测定法。

二、常规免疫测定法简介

（一）酶免疫测定法

酶免疫测定法是以酶作为标记物，标记抗原（药物）或抗体，与相应的抗体（或抗原）反应，形成酶-抗原-抗体复合物，通过标记酶对专一性底物的催化反应产生可测定的信号进行分析。酶免疫测定法具有很高的灵敏度。酶免疫测定法的典型代表是酶联免疫吸附测定

（ELISA）。

（二）荧光免疫测定法

荧光免疫测定法是以荧光物质作为标记物，标记抗体（或抗原），与相应的抗原（或抗体）反应，形成荧光物质-抗原-抗体复合物，根据荧光的存在与否来检测其是否存在。在实际工作中，用荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，也称为荧光抗体技术。

（三）发光免疫测定法

免疫反应中的酶作用于发光底物，使底物发生化学反应，发射出光子，利用发光信号测量仪器测定待测物质的含量。

（四）胶体金免疫测定法

胶体金免疫测定法是以胶体金标记抗体检测待测物质是否存在，也称为免疫胶体金技术，是一种快速检测技术。

三、酶联免疫吸附测定法（ELISA）

（一）基本概念

抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统产生免疫应答，生成抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。

抗体是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

（二）ELISA方法的原理

ELISA的抗原抗体反应具有特异性和等比例性。基于抗原抗体的特异性和等比例性，以96孔酶标板为载体，采用适当的技术使抗原或抗体吸附在酶标板的内壁上成为包被抗原或抗体，将没有被吸附的抗原或抗体通过洗涤除去，直接加入酶标记抗体或抗原，形成的酶标记抗原-抗体复合物吸附在酶标板的微孔内，然后将没有被吸附的酶标记物通过洗涤除去，在微孔内加入底物，吸附在酶标板微孔内的抗原-抗体复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物，通过分光光度计进行测定，在一定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。

（三）ELISA方法的分类

ELISA可分为直接ELISA法、间接ELISA法和夹心ELISA法。

直接ELISA法是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。直接ELISA法如图5-5所示。

图5-5　直接ELISA法

间接ELISA法是将酶标记在二抗上，当一抗和包被在酶标板的抗原结合形成复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以反映一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。间接ELISA法如图5-6所示。

图5-6　间接ELISA法

夹心ELISA法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，又称直接夹心法；也可以用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物，又称间接夹心法。夹心ELISA法如图5-7所示。

图5-7　夹心ELISA法

上述三种方法又可以分为竞争法和非竞争法。直接法中的酶标抗原竞争法较常用。

（四）酶标抗原竞争法的原理

将包被了抗体的酶标板微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入系列标准品溶液和酶标记物；同时在测定孔中加入待测样品和酶标记物，酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合位点，经过温浴后，没有结合到包被抗体上的酶标记物和样品经过洗涤除去。拍干后加入底物溶液，经温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。

（五）ELISA试剂的作用

1．固相载体

固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板（酶标板）、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。

2．免疫吸附剂

免疫吸附剂是将可溶性的抗原或抗体吸附到固相载体上，免疫吸附剂是ELISA方法中的核心试剂。

3．酶标记物

酶标记物即用酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。在ELISA中，常用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶作为标记用酶。

4．酶的底物

（1）辣根过氧化物酶的底物。常用邻苯二胺、四甲基联苯胺作为辣根过氧化物酶的底物。邻苯二胺经辣根过氧化物酶作用后产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492 nm处有最高吸收峰。四甲基联苯胺经辣根过氧化物酶作用后产物显蓝色，用酸终止酶反应后，产物由蓝色呈黄色，在450 nm处有最高吸收峰。

（2）碱性磷酸酶的底物。常用对硝基苯磷酸酯作为碱性磷酸酶的底物。对硝基苯磷酸酯在碱性磷酸酶的作用下生成黄色的对硝基酚，黄色的对硝基酚在405 nm波长处有吸收峰。

5．酶反应终止液

常用硫酸或盐酸作为酶反应终止液。

6．参考标准品

参考标准品用于制作定量测定的标准曲线。

结果用吸光度（A）表示。

资料单三　高效液相色谱技术

色谱是现代分析科学的一个重要分支，是一种应用最广泛的分离分析方法。色谱的应用范围涉及石油化工、环境污染物、医学临床、药品、农药和兽药残留等。

一、色谱分析原理

色谱体系中通常包括被分离组分、固定相和流动相，色谱的原理是根据不同组分在两相之间分配系数的差异，当两相做相对运动时，组分在两相中反复进行分配，分配次数达到几千次甚至几百万次，随着流动相的流动，不同组分移动距离的差异越来越明显，从而使这些组分得到分离。

二、典型色谱仪的构成

色谱分离分析操作是在色谱仪上完成的，典型的色谱仪如图5-8所示。

图5-8　色谱仪的构成

（李俊锁：《兽药残留分析》，2002年）

（1）泵：泵的性能决定流动相的流量或压力的稳定性，流量或压力直接影响定量的准确性。

（2）进样器：用来导入被分析样品。

（3）色谱柱：色谱柱是色谱仪器分离的核心，用于分离组分。

（4）温控器：用于控制色谱柱温。

（5）检测器：用于检测和识别从柱子流出的组分。

（6）数据处理系统：用于处理和输出从检测器传输的检测信息，并给出定量、定性和统计结果。

三、色谱法分类

根据流动相和固定相（或色谱柱）的不同，色谱法可以分为气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）、超临界流体色谱（SFC）、毛细管电泳（CE）等。气相色谱以气体为流动相，高效液相色谱以液体为流动相，超临界流体色谱的流动相为超临界流体，薄层色谱属平板色谱的一种，毛细管电泳是在电场力作用下进行分离的。

四、现代色谱技术的特点

现代色谱技术的特点有：分离效能高；分析速度快；检测灵敏度高；选择性高；应用范围广。

五、色谱分析的基本概念

1．色谱峰

将检测器检测出的色谱流出物的信号记录下来，当有组分随流动相进入检测器时，检测器输出信号随该组分浓度的改变而改变，得出信号由小到大再到小的一个曲线，即色谱峰。图5-9所示为典型的色谱流出曲线。

图5-9　典型的色谱流出曲线

2．基线

基线是柱中仅有流动相通过时，检测器响应信号的记录值，稳定的基线应该是一条水平直线。

3．峰高

峰高是色谱峰顶点与基线之间的垂直距离。

4．保留时间（体积）

保留时间即从进样到组分峰最高点出现的时间（体积）。当组分不被固定相保留时，所得保留时间（体积）也叫作死保留时间tR0（体积VR0），是载气（或流动相）通过色谱柱所需的时间（体积）。将保留时间（体积）扣除死时间（体积）即得到调整保留时间tR（体积VR）。

5．保留因子

保留因子也称分配比，即组分停留在固定相中的时间和在流动相中时间的相对值或在平衡状态下组分在固定相中的量和在流动相中的量的比值。

6．分配系统

分配系统是平衡状态下，组分在流动相中的浓度和组分在固定相中的浓度的比值。

7．相对保留值

相对保留值是组分与标准物质的调整保留时间或体积之比。

8．分离因子（选择性因子）

分离因子是两个相邻峰的相对保留值。

9．分离度

分离度是相邻两峰分开的距离与平均峰宽的比值。保留时间差异越大，峰越窄，分离效果越好。

10．响应因子

响应因子是指在同一条件下，同一检测器对等量的不同物质的响应值是不同的。但在一定范围内对同一物质，其响应值只与该物质的量（或浓度）有关。因此，可以在限定条件下利用成正比的关系来进行定量分析。

11．线性

线性是指进样量和信号值（峰面积）之间成正比关系，也就是成直线关系。

12．线性范围

线性范围是指成线性的最高浓度和最低浓度的比值。

六、色谱定性方法(www.daowen.com)

（一）保留值定性

将样品中组分的保留值与已知物质在相同操作条件下测得的保留值相比，如果数值在试验容许的误差范围内，就可以推定此组分可能是该物质。为了提高定性分析的可靠性，还可进一步改变色谱条件（如分离柱、流动相、柱温等）或在样品中添加标准物质，如果被测物的保留值仍然与标准物质一致，则可认为它们为同一物质。

（二）选择性检测器定性

选择性检测器只对某类或某几类化合物有信号，因此可用于判定被检测物质是否为此化合物，例如氢火焰离子化检测器（FID）仅对含碳的有机化合物有响应；紫外检测器（UVD）或荧光检测器（FLD）仅对在某波长范围内具有紫外吸收或荧光性质的物质有响应。两个或两个以上检测器串联或并联，还可以得到更多的定性信息。

（三）与其他仪器联用定性

将具有定性能力的分析仪器［如质谱（MS）、红外（IR）、原子吸收光谱（AAS）、原子发射光谱（AES，ICP-AES）等仪器］作为色谱仪的检测器，即可获得比较准确的定性信息。

（四）其他

其他方法有化学衍生化法、官能团定性法、保留值规律定性法等。在残留分析中，由于色-质联用技术的发展和普及，其他定性方法较为次要。

七、色谱定量方法

色谱定量分析的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。通常采用峰面积进行定量分析。

色谱定量首先必须解决的问题包括色谱峰的测量、峰面积或高度与组分质量或浓度的关系及其计算方法等。

（一）色谱峰的测量

峰高的测量是指从基线至峰顶点对每一个化合物的峰进行测量。峰高受流动相流速、柱温和检测器灵敏度的影响，当色谱峰分辨率不够、基线漂移或峰太小时，测量误差较大。

峰面积的测量目前使用的是积分仪和计算机进行检测和处理，可以进行基线和峰的检测、基线校正、面积积分和对重叠峰进行分解，响应因子可存入系统以备调用。

（二）计算方法

1．外标法

外标法就是用标准品的峰面积或峰高与其对应的浓度作一条标准曲线，测出样品的峰面积或峰高，在标准曲线上查出其对应的浓度。

外标法的表达式如下：

CX=AX·（CS/AS）=AX/SX

式中，CX为组分浓度，AX为组分峰面积，CS为标样浓度，AS为标样峰面积，SX为响应因子。

作为外标物应具备下列条件：要求外标物与被测组分为同一种物质，并且要有一定的纯度；分析时要求外标物的浓度应与被测物浓度接近，以利于定量分析的准确性。

外标法的优点：简便、不需要用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。

外标法的缺点：此方法的准确性受进样重复性和试验条件稳定性的影响。

2．内标法

内标法是在要测定的样品中加入已知量的内标物作为测定的比较标准，用待测物的峰面积和内标物的峰面积的比值进一步求得待测组分的浓度。可用下式表示：

CX=组分峰面积/内标物峰面积×相对响应因子

作为内标物应具备下列条件：不是样品中的组分，但与被测组分性质比较接近；能从样品组分中完全分离出来；纯度要求尽可能高；不与试样发生化学反应；出峰位置应位于被测组分附近，且不受组分峰的影响。

内标法的优点：进样量不超过限定的范围内，定量结果与进样量的重复性无关；被测组分及内标物出峰且分离度合乎要求时就可以定量。

内标法的缺点：样品配制比较麻烦，内标物不好找，没有标准曲线法定量精确。

3．归一化法

按照色谱定量分析的原则，由于组分的量与其峰面积成正比，如果样品中所有组分都能产生信号，得到相应的色谱峰，那么可以用如下归一化公式计算各组分的含量。

式中，Ci为组分浓度，A为组分峰面积，f为校正因子。

若样品中各组分的校正因子相近，则可将校正因子消去，直接用峰面积归一化进行计算。

归一化法的优点：简便、准确、定量结果与进样重复性无关。操作条件略有变化对结果影响较小。

归一化法的缺点：需要获得每个峰的峰面积，检测器对每个组分都产生信号，不适用于微量杂质的测定。

外标法和内标法是色谱分析常用的定量方法，适用于各种检测器。归一化法主要用于通用性检测器，如FID、UVD、FLD等。选择性检测器对不同结构物质的响应差别很大，一般不采用归一化法定量。

八、高效液相色谱仪的典型结构

典型的高效液相色谱仪（HPLC）包括储液器、高压输液泵、进样系统、分离柱、检测器、数据处理系统和恒温装置。

（一）储液器

储液器用于储存流动相。一般选择对使用溶剂惰性、能耐压力、便于脱气、容积足够大（1～2 L）的容器。

流动相在使用前的操作注意事项：流动相必须是色谱级的；流动相须过滤，流动相里有很微小的垃圾，如不经过过滤，会卡在阀门中，产生压力波动；流动相在使用前必须脱气，以免造成检测器噪声增大，基线不稳定。

常用的脱气方法有以下三种：

（1）超声波脱气法，将流动相瓶置于超声波清洗槽，以水为介质，超声30～60 min。

（2）吹氮气或氦气脱气法，将气体经过滤器导入流动相，保持压力0.5 kg/cm2，脱气10～15 min，必要时可适当加温或抽真空。

（3）仪器自动脱气，新型号的仪器均装有在线脱气机，可以满足正常流速下脱气的需要。

（二）高压输液泵

高压输液泵用于将流动相按一定的流速或压力输入色谱柱，使样品得到分离。一般要求输液泵流量稳定，精度达到0.1%，流速范围为0.001～10 mL/min，压力波动小，易于清洗和更换溶剂。

泵的日常维护方法：使用高质量试剂和HPLC溶剂；将流动相和溶剂过滤；脱气；每天工作前放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；不让水或腐蚀性溶剂滞留在泵中；定期更换垫圈；加润滑油等。

（三）进样系统

进样系统用来将一定量的样品引入色谱柱。自动进样器通过计算机控制，自动进行取样、进样、清洗等一系列操作。而操作者只需要键入样品的位置和进样参数即可。典型的自动进样器包括进样阀、进样针头、样品小瓶、样品支架和步进电动机等。

进样系统的保养方法：保持清洁和装配合理；工作结束后应冲洗掉缓冲溶液，样品应经过过滤和净化。

（四）分离柱

HPLC柱的结构为一根空心柱管，两端连接烧结过滤片和螺母，内填一定粒径的固定相。

1．柱的分类

柱根据分离方式可分为硅胶型和聚合物型两种类型。

（1）硅胶型：有正相；反相（C18）；离子交换［WAX（弱碱阴离子交换）、WCX（弱酸阳离子交换）、SAX（强碱阴离子交换）、SCX（强酸阳离子交换）］；凝胶过滤（Diol、GF）四大类型。

（2）聚合物型：有反相、离子交换、配位交换、离子排阻、凝胶过滤、凝胶渗透色谱、羟基磷灰石型七大类型。

聚合物型柱按尺寸分：有标准柱、快速色谱柱、小孔径柱。

2．色谱柱填料

最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用；正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等；离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂。

3．柱的使用和维护

柱子损坏表现为柱压升高，柱效下降，保留值改变，峰形畸变等。柱的质量直接影响样品组分的分离、组分的定性定量分析，所以在操作时必须十分注意。以反相柱为例，它要求填料处于甲醇或乙腈中，不使柱子干枯，并注意下列事项。

（1）勿使柱子受较强振动，检测器之间的连接应没有死区，HPLC柱的温度必须经过严格的控制。

（2）流动相与样品最好经过过滤处理，以防柱压升高，保留时间下降；当流动相从A换到B时，A、B不相溶，必须选择能同A、B互溶剂C，先换成C再把C换成B。

（3）水易繁殖微生物，使柱子堵塞，并降低柱效，因此当用水和甲醇（或乙腈）混合液体溶剂时，工作结束后必须用纯甲醇冲洗30 min至1 h，使柱子处于甲醇中。

（4）当使用缓冲液时，盐的浓度宜低，否则盐容易析出，柱效降低，柱压升高，使用后必须先用水替换缓冲液，冲洗使缓冲液排出，然后用甲醇冲洗。

（5）酸可使柱效降低，当流动相呈酸性时，使用后必须用水冲洗，然后用甲醇冲洗。

（6）较长时间不用时，应在柱中充满甲醇，并把两头封死，尽量不使柱子干枯。

（五）检测器

1．HPLC对检测器的要求

要求灵敏度高，线性范围宽，响应快，稳定性好，对流量、流动相组成和温度的变化不敏感，可靠性好，噪声低，漂移小，不破坏组分，死体积小，适用范围广，操作简单，维修方便。

2．检测器的性能指标

（1）噪声和漂移：在仪器稳定之后，记录基线1 h，基线带宽为噪声，基线在1 h内的变化为漂移。噪声和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小。

（2）灵敏度：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。

（3）检测限：检测限是指恰好产生可辨别的信号（通常用2倍或3倍噪声表示）时进入检测器的某组分的量（单位为g/mL 或 mg/mL），又称为敏感度，D=2N/S，式中D为检测限，N为噪声，S为灵敏度。检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。

（4）线性范围：是指检测器的响应信号与组分含量成直线关系的范围，即在固定灵敏度条件下，最大与最小进样量之比。也可用响应信号的最大与最小的范围值表示。

3．残留分析常用检测器

紫外-可见检测器（UVD）、荧光检测器（FLD）是HPLC使用的主要检测器。

（1）紫外-可见检测器（UVD）。UVD是HPLC中应用最广泛的检测器，绝大多数HPLC系统都配备该检测器。当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外-可见检测器。UVD灵敏度高，选择性较好，能满足残留分析的一般要求。UVD的检测依据是Beer定律。

（2）荧光检测器（FLD）。FLD灵敏度较UVD高一个数量级，选择性强，但具有荧光性质的药物较少，FLD主要用于一些芳香化合物的检测，许多低浓度残留组分常用荧光衍生化法进行检测。荧光检测器的原理是物质在紫外光的照射下，吸收特定波长的光，使外层电子从基态跃迁到激发态。当处于第一激发态的电子回到基态时，会发射比原来吸收的光波长更长的光，即荧光。这种吸收的光叫作激发光，波长为激发波长λex，发射的荧光叫作发射光，波长为发射波长λem。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。

（六）数据处理系统

数据处理系统包括三个部分：采集、处理和分析数据；控制仪器；色谱系统优化和高级用户系统。

（七）恒温装置

色谱柱及某些检测器要求能准确控制工作环境温度，柱子的恒温要求为±0.5 ℃，不同的检测器对温度的敏感度不一样，紫外检测器在温度波动绝对值超过0.5 ℃时，就会造成基线漂移，示差折光检测器的灵敏度和最小检出量取决于温度控制的精度，需将温度控制在±0.001 ℃。

九、常用的流动相

1．有机溶剂

反相：乙腈、异丙醇、二氯甲烷、甲醇、乙醇。

正相：己烷、环己烷、四氯化碳。

2．酸

乙酸、甲酸、三氟乙酸（正离子）。

3．缓冲液

乙酸铵、甲酸铵。

作 业 单

一、简答

1．HPLC的通用型检测器有哪些？各有什么特点？

2．液-固吸附色谱法中的固定相和流动相有什么特点？

3．化学键合相色谱中的固定相和流动相有什么特点？

二、论述

根据所学的知识试述高效液相色谱法的原理及应用特点。怎样做好高效液相色谱的检测？

三、课外能力拓展

查阅资料，学习酶标仪的原理及操作过程。

评 估 单

【评估内容】

一、名词解释

1．抗原　2．抗体　3．色谱峰　4．保留时间

二、简答

1．简述酶联免疫吸附测定法抗原抗体的基本特性。

2．简述直接ELISA法原理。

3．简述间接ELISA法原理。

4．典型的色谱仪由哪些基本单元组成？

5．定性和定量的方法有哪些？

6．典型的HPLC包括哪些？

7．HPLC的通用型检测器有哪些？各有什么特点？

备注：项目二十六学习情境占模块五总分的20%。