【基本概念】

液液萃取、气流吹蒸法

【重点内容】

液液萃取、固相萃取，旋转蒸发器浓缩法、气流吹蒸法操作。

【教学目标】

熟悉残留分析的主要特点，学会样品前处理操作技术。

资 料 单

一、残留分析的主要特点

兽药残留分析属复杂基质中痕量组分的分析技术，与药品或制剂分析有很大不同。兽药残留分析的特点概括为如下四个方面。

（1）待测物质浓度低，浓度波动范围大。待测物质浓度低、浓度波动范围大是残留分析的显著特点，残留水平多数为1　μg/kg～1　mg/kg。

（2）样品基质复杂，干扰物质多。不同种属动物的样品、同种动物的不同组织器官的成分有明显差异，样品基质成分复杂，除此之外，其他干扰因素还有药物自身的代谢产物、动物日粮成分和环境污染物等。

（3）需要精细的微量操作手段和灵敏度高、选择性强的检测技术。

（4）残留检测以仪器分析方法为主。残留样品要求分析技术具有灵敏度高、选择性或分离能力强和线性范围宽的特点。而传统意义上的化学分析方法不能满足残留分析的需要，必须采用仪器分析方法。

二、样品的采集、制备与储存

1．样品采集

残留分析样品主要是各种食用组织，如肌肉、脂肪、肝、肾、皮肤、血液、蛋、奶及其加工食品；活体检测中一般采集血浆、尿液和粪便；屠宰现场主要采集某种药物的靶组织及其他高浓度的样本，如肝、肾、胆汁、注射部位的组织等。采集时应根据具体的测定需要，遵循代表性原则进行随机采样。

2．样品制备

样品制备又称为样品预处理，是指采样后至化学分析前试样的准备工作，包括样品匀化、缩分、过筛、离心、过滤、防腐和抑制降解等过程。样品制备是采样工作的继续。

3．样品储存

为避免样品组分被降解，通常采用样品深度冷冻的方法进行储存。冷冻能延缓样品变化的速度，对一些易于代谢的药物，如磺胺类、甾类同化激素类药物，它们的肝或肾组织样品不宜长时间存放，理想的冷冻温度为-40 ℃～-80 ℃。

三、样品提取

（一）组织捣碎法

“样品+溶剂”高速捣碎2～3 min，组织匀浆和样品萃取，过滤或离心，将残渣重复提取1～3 次，合并滤液或上清液。

（二）振荡提取法

“样品匀浆物+溶剂”中速振荡30～60 min，过滤或离心，将残渣重复提取1～3次，合并滤液或上清液。

（三）超声波辅助提取法

超声波辅助提取法是通过空化作用使分子运行速度加快，同时将超声波的能量传递给样品，使组分脱附和溶解加快。操作中将样品和溶剂放于密闭的试管中，置于具有一定能量的超声波水浴，数秒后拿出，如此反复数次后即可达到提取目的。每次超声时间宜短，以防止溶剂过热沸腾，影响提取回收率。超声波辅助提取法操作简单、一次可以同时提取多个样品，提取时间短、速度快、提取效率高。

（四）索氏提取法

使用索氏提取器进行提取。索氏提取法操作简便，不需要转移样品，不受样品基质影响，是一种彻底提取法。但是索氏提取法提取时间长，需耗用较多溶剂（每个样品300～500 mL），需对提取液进行浓缩。索氏提取法适用于水分较少的样品如饲料等的提取，动物组织样品须与海沙或无水硫酸钠一起研磨，制成干粉后再进行提取。

（五）消化法

消化法主要用于常规方法无法提取的样品基质如毛发、角质、骨头等及组织结合力强的组分的处理。

1．酸消化法

消化液为“60% hClO4-冰HOAc（1+1）”的混合液，反应条件控制在 80 ℃～90 ℃。

2．碱消化法

常用的消解试剂有甲醇钾、乙醇钾、甲醇钠、乙醇钠溶液，还可以直接向溶剂中加入氢氧化钠。反应条件一般控制在60 ℃。

3．酶消化法

常用枯草菌溶素作为蛋白水解酶。反应条件：pH值为7.0～11.0，50 ℃～60 ℃。

（六）超临界流体提取法

以超临界状态下的流体为萃取溶剂，利用该状态下的流体所具有的高渗透能力分离混合物的过程。最常用的超临界流体是CO2，可用于萃取非极性和中等极性的物质，如加入适量极性调节剂，还可萃取极性物质。

（七）微波辅助萃取

微波辅助萃取是利用微波加热，加速溶剂对固体样品中目标物的萃取过程。微波辅助萃取具有快速、高效、节能、环境友好等特点。微波辅助萃取的时间短，有机试剂消耗量少，可同时测定多个样品。

（八）其他技术

1．冷冻干燥

先将样品冷冻，水分在样品表面形成“冰壳”，将其置入冻干机进行减压干燥。冰升华时可将其他挥发性杂质一道除去，样品被干燥，向残渣中加入有机溶剂进行萃取。也可将冻干的样品研成细末，与适量吸附剂或助滤剂混合装柱淋洗。该方法适用于含水样品中热稳定性差、水溶性强的组分的预处理，也可用于样品衍生化或储存前的预处理。

2．制备“干混合物”

先将液态或固态样品与足量的无水硫酸钠或无水硫酸镁混合研磨制成“干混合物”，然后用溶剂萃取或装柱淋洗，该方法适用于水溶性强的组分提取。

3．起泡分离

利用泡沫除去溶解物质，常用于浓缩和分离水中的洗涤剂或其他表面活性剂。

四、样品净化

将待测组分与杂质分离的过程称为净化。提取过程可除去99%以上的样品基质，而不到1%的共萃取物是主要的干扰杂质，这些杂质可干扰光谱检测、增加基线噪声、降低柱效、阻塞色谱管路、污染色谱柱和检测器、干扰色谱分离过程，直接影响定量和定性分析质量。因此，为保证测定的正常进行，必须在净化过程中除去这些杂质。在实际操作中可根据待测物的理化性质结合多种分离方法设计净化过程，如待测物的极性、溶解性、酸性或碱性、分子质量等。

净化过程常用的方法有液液萃取、固相萃取，除此以外还有固相微萃取、基质固相分散技术、免疫亲和色谱技术、分子印迹技术、加速溶剂萃取等新技术。

（一）液液萃取（LLE）

液液萃取是一种利用待测组分与样品杂质在互不相溶的两相中溶解性差异进行净化的方法，属经典的净化方法。使用LLE很容易将溶质分为两个组分：极性组分与非极性组分。极性物质可再分成酸性、碱性或中性物质。

1．常用的萃取溶剂对

萃取溶剂对一般由非极性溶剂和极性溶剂组成，残留净化中常见的溶剂对，如正己烷（或石油醚）-乙腈、正己烷-甲醇、正己烷-丙酮、异辛烷-80%丙酮、氯仿-水、乙酸乙酯-水。

2．影响液液萃取的因素

（1）溶剂。按“相似相溶”原理选择溶剂。萃取溶剂的极性越小，共萃取的杂质越少，选择性越高。可采用少量多次抽提、不等体积抽提等萃取方法。

（2）pH值。pH值对酸碱性物质的溶解或分配系数影响很大，可采用酸碱萃取法进行净化。调节pH值使组分水相处于中性分子状态，或达到两性分子的等电点，组分水溶性降低，易被有机溶剂萃取；调节pH值使组分呈解离状态，水溶性增加，根据这种性质可使酸性或碱性水溶液从有机溶剂中反萃取碱性或酸性组分。这种萃取方法能选择性地除去中性、酸性或碱性杂质和提高萃取效率。

（3）离子对试剂。酸性或碱性较强的有机物在水中解离为亲水性很高的离子，通过控制pH值不能完全抑制它们的解离，因此难以用有机溶剂进行萃取净化。但是可以向呈解离状态的待测物溶液中加入与其电性相反的离子对试剂（反离子），两者结合形成具有一定脂溶性的离子对（水相），可被有机溶剂萃取。这种方法称为离子对萃取法。

（4）盐析。向溶液中加入中性强电解质（如氯化钠、硫酸钠等）会促进溶质的析出，这种现象称为盐析。盐析可降低萃取乳化和有机相与水相分层；盐析可促进有机溶剂萃取，如向样品中加入适量无水硫酸钠可提高药物的提取效率。盐析操作简单，但盐析常导致更多的共萃取杂质。

（5）其他。萃取中溶液发生乳化，可使溶解的部分组分不能回收，乳化现象可以使萃取时间延长、回收率下降。因此，操作过程中应避免乳化现象的出现。

3．液液萃取操作注意事项

液液萃取是最基本的净化方法，通常采用分液漏斗振荡法、涡旋萃取、逆流萃取、特殊容器萃取等。

液液萃取操作时，可采用如下措施防止溶剂中带水、样品乳化、药物吸附损失。

（1）从水相萃取药物时溶剂中常带入少量水分，可使用无水硫酸钠进行脱水。

（2）样品乳化时，可进行离心或静置等待，也可试用添加溶剂或盐析法。

（3）为防止吸附损失，可向萃取溶剂中加入一些异丙醇或二乙胺，也可将玻璃器皿进行硅烷化处理。方法是用含1%三甲基氯硅烷的甲苯溶液将干燥的玻璃器皿浸一次，然后于100 ℃干燥30 min备用。

（二）固相萃取（SPE）

固相萃取是指使用预制的装有各种色谱填料的固相萃取小柱（SPE柱）的分离方法。SPE柱一般由柱体、固定相和滤板三部分组成，典型的SPE柱结构如图5-3所示。

图5-3　SPE柱结构 (www.daowen.com)

1—样品室；2—管壁；3—滤板；　4—填料；5—滤板

1．SPE填料

SPE采用的填料接近HPLC的固定相，分为正相固定相、反相固定相和离子交换固定相。

根据相似相溶原理，尽可能选择极性与待测组分相近的固定相，使组分得到最佳保留。分析中等极性物质时，反相或正相固定相均可；分析非极性或低极性物质时，选用反相固定相；分析离子型或较强的有机酸或有机碱化合物时，可选择离子交换固定相。

2．洗脱溶剂

洗脱溶剂的作用随固定相种类和组分性质的不同而有所不同。

在用于正相机理的组分洗脱时，极性越强的溶剂洗脱能力越强。在用于反相机理的组分洗脱时，极性越强的溶剂洗脱能力越弱。不同溶剂的溶剂强度顺序见表5-3。在反相SPE中极性高的组分先流出，正相SPE中的组分流出顺序正好相反。

表5-3　洗脱溶剂强度

离子交换固定相上组分的保留和洗脱取决于流动相中的离子强度、反离子强度和pH值，与溶剂强度关系较小。阴离子和阳离子交换固定相的相对反离子强度见表5-4。离子强度和反离子强度越强，分析物越易被洗脱；反之，保留越强。

表5-4　相对反离子强度
（李俊锁：《兽药残留分析》，2002年）

3．SPE操作步骤

SPE操作一般有四步：固定相活化、样品上柱、洗涤和洗脱。

（1）固定相活化。活化的目的是除去柱内杂质并创造一定的溶剂环境。操作步骤通常是先用一种强洗脱能力的初始溶剂润湿和净化SPE柱，然后用弱洗脱能力的终溶剂平衡SPE柱。

柱床活化操作注意事项如下：

100 mg固定相用1～2 mL溶剂平衡；在活化过程中和上样之前不要让空气进入柱内，也不要让液体流干，以防柱床出现裂隙，影响回收率、重复性和净化效果；终溶剂的强度应比样品溶剂强度低或接近，以免样品被带出造成回收率下降。

（2）样品上柱。样品上柱操作注意事项如下：

尽可能用弱溶剂溶解样品，使组分在柱上有强保留，在柱床起始部位形成窄的谱带；对于必须用强溶剂提取的样品，上柱前用弱溶剂稀释至适宜强度，避免样品的溶剂强度过高或体积过大，造成柱床穿漏，使回收率降低；将样品流速控制为3～10 mL/min，以保证良好的净化效果。

（3）洗涤。洗涤是除去不需要的组分或杂质。洗涤所选溶剂的强度一般略强于或等于样品溶剂。洗涤溶剂体积一般为每100 mg填料用0.5～0.8 mL洗涤溶剂。

（4）洗脱。洗脱是将所需组分从柱上淋洗下来。

洗脱操作注意事项如下：

洗脱溶剂的选择必须十分谨慎，溶剂强度应适宜，以保证用较小体积的溶剂将组分淋洗下来，并且避免洗出不必要的组分，通常采用混合溶剂作为洗脱溶剂。当洗脱溶剂与洗涤溶剂互不相溶时，可用空气或氮气对柱床进行干燥后再洗脱。洗脱溶剂的体积一般控制为（0.5～0.8 mL）/100 mg为宜。

图5-4所示为一个反相SPE柱的洗脱分布图，显示30%甲醇能洗出一些组分，70%甲醇则洗出所有组分。因此，选择70%甲醇作为洗脱溶剂，20%甲醇可作为洗涤溶剂。高于80%的甲醇可洗出不必要的杂质。

图5-4　洗脱分布图

（李俊锁：《兽药残留分析》，2002年）

（三）基质固相分散技术

基质固相分散技术是将涂渍有C18等多种聚合物的担体固相萃取材料与样品一起研磨，将所得的半干状的混合物作为填料装柱，然后采用类似SPE　的方法洗脱出各种待测物。

（四）固相微萃取

用涂渍在石英玻璃纤维上的固定相作为吸附介质，对目标物质进行萃取和浓缩，在进样口直接加热解析，或用流动相冲洗到液相色谱柱，用色谱进行分析。

（五）搅拌棒吸附萃取

将外层固定有吸附剂的萃取棒直接放入样品进行萃取。

（六）膜萃取

在选择性透过膜两侧加推动力，使样品一侧中的欲分离组分选择性地通过膜，从而达到分离纯化的目的。

（七）液相微萃取

液相微萃取是样品与μL　级甚至nL　级的萃取溶剂之间的分配平衡，是把微滴溶剂置于流动的溶液中来实现溶质的微萃取方法。

（八）加压液体萃取

加压液体萃取是通过升高温度和压力来增加物质溶解度和提高溶质的扩散效率的样品前处理技术。

（九）分子印迹技术

分子印迹技术是将要分离的目标分子与功能担体通过共价或非共价作用进行预组装，与交联剂共聚制备得到聚合物，作为SPE　的填充剂或SPME　的涂层填料，用于分离复杂样品中的分析物。

（十）免疫亲和色谱技术

免疫亲和色谱技术是一种利用抗原抗体特异性、可逆性结合特性的SPE　技术，根据抗原抗体的特异性亲和作用，从复杂的待测样品中提取目标物质。

五、样品的浓缩与富集

在残留分析中，经过提取和净化后，必须对组分进行浓缩和富集，使供测定的样品达到仪器能够检测的浓度或进行溶剂转换。

浓缩是指通过减少样品溶液中的溶剂或水分而使组分的浓度升高；富集常指利用液固萃取的方法浓缩某种组分。溶剂挥发是常规的浓缩方法，常用的有减压蒸馏和气流吹蒸两种方式。

1．旋转蒸发器浓缩

旋转蒸发器是残留分析中最常用的浓缩装置，包括旋转烧瓶、冷凝器、溶剂接收瓶、真空设备、加热源和电动机。在烧瓶的缓缓转动时，液体在瓶壁展开成膜并在减压和加热条件下被迅速蒸发。旋转的烧瓶还可防止液体发生暴沸。该方法的浓缩速度快，溶剂可以回收。

2．气流吹蒸法

气流吹蒸法是常用的浓缩方法。利用空气或氮气流将溶剂带出样品，一般在加热条件下进行，该方法多用于少量液体的浓缩，但蒸汽压较高的组分易损失。

浓缩过程中组分最易损失，不要将样品直接蒸干，必须干燥时应在最后缓缓吹入氮气或空气。加入少量不干扰测定的高沸点物质，减少吸附损失。

作 业 单

1．查阅资料，学习免疫亲和色谱的原理及操作过程。

2．根据调研报告的写作格式，有针对性地完成参观考察净化方法中的任何一种方法的实践操作过程。

评 估 单

【评估内容】

一、名词解释

1．液液萃取　2．气流吹蒸法　3．超临界流体萃取　4．分子印迹　5．免疫亲和色谱

二、简答

1．残留分析的主要特点是什么？

2．兽药残留分析中常采集的样品有哪些？

3．SPE小柱活化时应注意的事项有哪些？

4．水溶性溶剂提取动物组织样品的优点有哪些？

5．常见的提取方法有哪些？

6．常见的净化方法有哪些？

7．浓缩与富集的方法有哪些？

【评估方法】

以小组为单位进行评估，每组推选2人，随机抽2题进行回答，采用百分制进行评价。

备注：项目二十五学习情境占模块五总分的15%。