【基本概念】

挥发性盐基总氮

【重点内容】

1．挥发性盐基总氮（TVBN）的测定，半微量定氮法（GB 5009.228—2016）。

2．病死畜禽肉的实验室检验。

【教学目标】

1．知识目标

熟悉鲜（冻）畜、禽产品理化检验指标，了解影响鲜（冻）肉类质量的因素及常检理化项目。

2．技能目标

掌握肉新鲜度及病死畜禽肉的实验室检验方法，具备对检验结果进行综合分析判定的能力。

资 料 单

一、鲜（冻）畜、禽产品理化检验指标

目前，我国鲜（冻）畜、禽产品理化检验采用的标准是《食品安全国家标准 鲜（冻）畜、禽产品》（GB 2707—2016）、《食品安全国家标准 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）。检验指标见表4-3。

表4-3　鲜（冻）畜、禽产品理化检验标准

二、影响鲜（冻）肉类质量的因素及常检理化项目

鲜（冻）肉类中微生物易于生存和繁殖，其卫生质量直接关系到广大消费者的身体健康。在实践中，鲜（冻）肉类出现的主要质量问题是病死畜禽肉的鉴定及肉在保藏过程中的新鲜度质量指标变化。

在感官指标中，肉的组织状态、黏度、气味、煮沸后肉汤等指标，是相当直观的质量指标，真实地反映了肉品在屠宰加工过程中受污染的情况、储存运输时的温度环境、库存时的变化，甚至更深层次地反映了肉中成分之间的关系是否保持或接近动物活体时的状况。因此，肉的感官指标检查和品评的重要意义是不言而喻的。

病死畜禽肉品及健康肉品的新鲜度感官检验虽然简便易行，也相当灵敏准确，但有一定的局限性。许多情况下，尚需进行实验室检验，并且尽可能注意它们之间的相互联系和相互补充。在实验室中，通过肉品的放血程度检验、细菌内毒素的呈色反应、过氧化物酶反应等来鉴别病健肉和色泽异常肉。肉品的新鲜度理化检验是根据肉中蛋白质等物质的分解产物，用物理学检验和化学检验方法对肉的新鲜程度进行检验。物理学检验是根据蛋白质分解，低分子物质增多，导电率、黏度、保水量的变化来衡量肉的品质；化学检验是用定性或定量方法测定分解产物，如氨、胺类、挥发性盐基氮、三甲胺、吲哚等来评定肉的新鲜度。

肉类腐败变质的分解产物极其繁杂，检测方法很多，但测定肉中挥发性盐基氮能有规律地反映肉品质量，是评定肉新鲜度的客观指标，是国家现行食品卫生标准中唯一的理化指标。其他方法，如pH值的测定、氨的检测、球蛋白沉淀试验、硫化氢试验和过氧化物酶反应等可作为参考指标。

目前，肉品的理化检验指标仍侧重于新鲜度，在畜禽的生长周期中，可能接触到农药、兽药和环境污染物。如抗生素、激素、磺胺类、有机砷制剂、有机磷化物等，这些物质的监测也日益引起人们的关注。

技 能 单

一、材料与设备

肉理化指标测定常规仪器及试剂。

二、方法与步骤

（一）病死畜禽肉的实验室检验

病死畜禽肉的实验室检验包括细菌学检验和理化检验。细菌学检验主要采集病变组织、器官，制备触片或抹片、染色镜检。理化检验包括过氧化物酶反应、硫酸铜肉汤试验、细菌内毒素的呈色反应、黄疸肉与黄脂肉的鉴别。

1．过氧化物酶反应

（1）原理。过氧化物酶只存在于健康动物的新鲜肉中，过氧化物酶可以使过氧化氢分解，产生新生态氧，将联苯胺氧化成蓝绿色化合物，经过一定时间变成褐色。而有病动物肉中无过氧化物酶或者含量甚微。据此，用以鉴别有病动物肉。

（2）试剂。

①0.2%联苯胺酒精溶液：称取0.2 g联苯胺，溶于100 mL95%酒精中。

②1%过氧化氢溶液。

（3）设备和材料。滴管、刀、镊子。

（4）测定步骤。在肉新鲜切面上，加1%过氧化氢溶液2滴和0.2%联苯胺酒精溶液5滴，观察颜色变化。

（5）结果判定。

①健康新鲜肉：出现蓝绿色斑点，继之变成褐色。

②病死畜禽肉：颜色不发生变化，且无斑点。

2．硫酸铜肉汤试验

（1）原理。有病动物生前体内组织蛋白质已发生不同程度的分解，形成小分子蛋白质及多肽类物质，在加热被检肉汤时，蛋白发生凝固，可用滤纸过滤除去，但蛋白分解产物仍然保留在滤液中。小分子蛋白质和多肽类可与硫酸铜试剂中的Cu2+结合生成难溶于水的蛋白盐沉淀，以此判定是否为有病动物肉。

（2）试剂。5%硫酸铜溶液：称取7.82 g硫酸铜（CuSO4·5H2O），溶解于100 mL蒸馏水中。

（3）设备和材料。具塞锥形瓶、水浴锅、试管、吸管、试管架。

（4）测定步骤。

①制备肉汤：称取20 g精肉肉样，剪碎后置于250 mL锥形瓶中，加入60 mL蒸馏水，混合后加塞置沸水浴中10 min，取出，冷却后将肉汤用滤纸过滤，备用。

②检验操作：取2mL滤液于试管中，加3滴5%硫酸铜溶液，用力振荡2～3次，静置，5 min后观察结果。

（5）结果判定。

①健康新鲜肉：肉汤透明（-）或轻度浑浊（+）。

②有病动物肉：肉汤出现絮状沉淀（++）或肉汤变成胶冻状（+++）。

3．细菌内毒素的呈色反应

（1）原理。在大多数有病动物肉及变质肉中，有细菌及其内毒素存在，这些内毒素能降低肉类或被检肉浸出液的氧化还原势能。在肉浸出液中加入硝酸银溶液，可形成氧化型毒素，这种氧化型毒素具有阻止氧化还原指示剂退色的特性。当肉浸出液中存在氧化型毒素时，可与高锰酸钾起反应，此时肉浸出液呈现出指示剂的颜色（蓝色）。当肉浸出液中无氧化型毒素存在时，指示剂被还原退色而呈现出高锰酸钾的颜色（红色）。

本方法能检出大肠埃希氏菌、变形杆菌、沙门氏菌、结核分枝杆菌和荚膜型炭疽杆菌，不能检出腐物寄生菌、红斑丹毒丝菌和芽孢型炭疽杆菌。

（2）试剂。

①1%甲酚蓝酒精溶液：称取1 g甲酚蓝，溶于100 mL95%酒精中，置于37 ℃恒温箱存放2 d，然后用滤纸过滤即成。

②0.1 mol/L氢氧化钠溶液：吸取5.6 mL澄清的氢氧化钠饱和溶液，加适量新煮沸过的冷水至1 000 mL，摇匀。

③灭菌生理盐水。

④5%草酸溶液：称取7 g草酸，溶于100 mL蒸馏水。

⑤0.5%硝酸银溶液：称取0.5 g硝酸银，溶于100 mL蒸馏水。

⑥盐酸溶液：量取2份浓盐酸加于3份蒸馏水中，混匀即可。

⑦1%高锰酸钾溶液：称取1 g高锰酸钾，溶于100 mL蒸馏水。

（3）设备和材料。玻璃研钵、镊子、剪刀、玻璃棒、100 mL具塞三角烧瓶、玻璃漏斗、10 mL吸管等均需灭菌。

（4）测定步骤。

①制备毒素抽提液：采用无菌操作法进行操作，取10 g精肉样品置于研钵，用剪刀仔细剪碎，加入10 mL灭菌生理盐水和10滴0.1 mol/L氢氧化钠溶液，仔细研磨。将所得肉浆移入100 mL三角瓶，加塞，水浴中加热至沸腾，取出后置冷水中冷却，加入5滴5%草酸溶液，最后用滤纸过滤备用。

②毒素检测：取灭菌试管1支，加入毒素抽提液2 mL，依次加入1%甲酚蓝酒精溶液1滴、0.5%硝酸银溶液3滴、盐酸溶液1滴。用力振摇后，用微量吸管准确加入1%高锰酸钾溶液0.15 mL，振摇后立即观察结果，经过10～15 min后再观察一次，以第二次的观察结果为最终结果。

另取1支试管，用生理盐水或已知健康新鲜肉的抽提液，做空白对照试验。

在白色背景上观察结果，操作结束后立即观察一次，经过10～15 min后再观察一次，以第二次的观察结果为最终结果。

（5）结果判定。

①健康动物新鲜肉呈玫瑰红色或红褐色，经30～40 min后变为无色。

②有病动物的肉呈蓝色。毒素含量少时，则呈蓝紫色，颜色随微生物毒素量的变少由蓝色到黄绿色。

4．黄疸肉与黄脂肉的鉴别（氢氧化钠法）

（1）原理。黄疸肉是由于胆红素大量进入血液，将全身各组织染成黄色。黄脂肉是由于饲料因素或遗传因素，脂肪组织形成的非饱和脂肪酸叠合物小体使皮下或腹腔脂肪组织染成黄色。

在肉品卫生质量感官检验时，黄疸肉与黄脂肉有时难以区分，需要进行实验室检验，这对于检出病理性黄疸肉，特别是钩端螺旋体病猪肉，具有重要意义。

（2）测定步骤。取2 g脂肪放于试管，加5 mL5%氢氧化钠溶液，在火焰上加热煮沸，持续1 min，振摇试管，在流水下冷却至40 ℃～50 ℃。小心加入2.5 mL乙醚，轻轻混匀或加入1～2滴乙醇，加塞静置，待溶液分层后进行观察。

（3）结果判定。当有胆红素存在时，上层乙醚液无色，下层液体呈黄绿色；如上层乙醚液染成黄色，下层液体无色，则是天然色素；如上、下两层液体均为黄色，则说明两种色素同时存在。

（二）肉新鲜度检验

肉新鲜度的实验室检验方法较多，如挥发性盐基氮的测定、pH值的测定、残留、球蛋白沉淀试验、纳斯勒氏试剂（Nessler）反应、氨反应等。但只有挥发性盐基氮作为我国现行法定的肉新鲜度检验的理化指标，其他实验室检测方法只能作为肉新鲜度的辅助检验方法。

1．挥发性盐基氮（TVBN）的测定（GB 5009.228—2016）

（1）半微量定氮法。

①原理。挥发性盐基氮是指动物性食品在酶和细菌的作用下，使蛋白质分解产生氨及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，在碱性溶液中被蒸馏出来后，用标准酸溶液滴定，计算含量。

②试剂。

a．氧化镁混悬液（10 g/L）：称取1.0 g氧化镁，加100 mL水，振摇成混悬液。

b．硼酸吸收液（20 g/L）：称取20 g硼酸，加1 000 mL水，混匀。

c．0.01 mol/L盐酸标准滴定溶液。

d．甲基红-乙醇指示剂（2 g/L）。

e．次甲基蓝-乙醇指示剂（1 g/L）。

临用时将d、e两种指示剂等量混合为混合指示液。③仪器。

a．半微量定氮装置（图4-13）。

b．微量滴定管：最小分度为0.01 mL。(www.daowen.com)

④测定步骤。

a．滤液制备：将试样除去脂肪、骨及腱后，切碎搅匀，称取10.0 g，置于锥形瓶，加100 mL水，不时振摇，浸渍30 min后过滤，滤液置于冰箱备用。

b．蒸馏滴定：在锥形瓶中加入硼酸吸收液10 mL，混合指示液5～6滴，将冷凝管下端插入锥形瓶内吸收液的液面下；准确吸取5.0 mL滤液于蒸馏器反应室，并加入氧化镁混悬液5 mL，迅速盖塞，加水以防漏气，通入蒸汽；蒸馏5 min即停止，吸收液用0.01　mol/L盐酸标准滴定溶液滴定，终点至蓝紫色，同时做试剂空白试验。

⑤结果计算。试样中挥发性盐基氮的含量按下式进行计算。

式中　X1——　样品中挥发性盐基氮的含量［mg/（100 g）］；

V1——　测定用样液消耗盐酸标准溶液的体积（mL）；

V2——　试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积（mL）；

c1——盐酸标准溶液的实际浓度（mol/L）；

14—— 与1.00 mL盐酸标准滴定溶液［c（HCl）=1.000 mol/L］相当的氮的质量（mg）；

m1——样品质量（g）。

计算结果保留3位有效数字。

⑥精密度。在重复试验条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（2）微量扩散法。

①原理。挥发性含氮物质可在37 ℃碱性溶液中释出，挥发后吸收于吸收液，用标准酸溶液滴定，计算氮含量。

②试剂。

a．饱和碳酸钾溶液：称取50 g碳酸钾，加50 mL水，微加热助溶，静置，用上清液。b．市售胶水。

c．吸收液、混合指示液、盐酸标准滴定溶液（0.01 mol/L）同半微量定氮法。

③仪器。

a．扩散皿（标准型）：玻璃质，内外室总直径35 mm：外室深度10 mm，内室深度5 mm；外室壁厚3 mm，内室壁厚2.5 mm；加磨砂厚玻璃盖。微量扩散皿结构如图4-14所示。

图4-13　半微量定氮装置

1—电炉；2—蒸汽发生器；3—反应室；　4—冷凝管；5—蒸馏液接收瓶　
（张彦明：《动物性食品卫生学实验指导》，2006年）

图4-14　微量扩散皿结构

b．微量滴定管：同半微量定氮法。

④测定步骤。将胶水涂于扩散皿的边缘，在皿内室加入1 mL硼酸吸收液及1滴混合指示液。在皿外室一侧加入1 mL试样滤液，另一侧加入1 mL饱和碳酸钾上清液，注意勿使两液接触，立即盖好磨砂玻璃盖；密封后将皿置于桌面上轻轻转动，使样液与碱液混合，置于37 ℃恒温箱放置2 h，取出，用少量水从边缘润胶后揭去盖，用0.01 mol/L盐酸标准滴定溶液滴定，终点呈蓝紫色，同时做试剂空白试验。

⑤结果计算。试样中挥发性盐基氮的含量按下式进行计算。

式中　X1、V1、V2、c1、14、m1同半微量定氮法。

⑥精密度。同半微量定氮法。

2．pH值的测定

（1）原理。家畜生前肌肉的pH值为7.1～7.2。宰后由于缺氧，肌糖原无氧酵解，产生乳酸，三磷酸腺苷（ATP）迅速分解，产生磷酸，使肉的pH值下降。如宰后1 h的鲜肉，其pH值可降到6.2～6.3，24 h后pH值降到5.6～6.0。此pH值在肉品加工中叫作“排酸值”，它能一直持续到肉发生腐败分解之前。新鲜肉浸出液的pH值通常为5.8～6.2。肉腐败时，由于肉内蛋白质在细菌酶的作用下，被分解为氨和胺类化合物等碱性物质，因而使肉趋于碱性，pH值显著增高。

此外，家畜在宰前由于过劳、虚弱、患病等使能量消耗过大，肌肉中的糖原减少，所以宰后肌肉中形成的乳酸和磷酸量也较少。在这种情况下，肉虽具有新鲜肉的感官特征，但有较高的pH值，为6.5～6.6。因此，在测定肉浸液pH值时，要考虑这方面的因素。测定肉的pH值的方法，通常有比色法和电化学法。

（2）设备和材料。天平、量筒、烧杯、锥形瓶、刻度吸管、剪刀、pH值精密试纸、酸度计。

（3）测定步骤。

①肉浸液的制备。称取精肉肉样10 g，切成碎末，置于200 mL烧杯，加100 mL蒸馏水，浸泡15 min，其间不时振摇，后过滤备用。

②测定方法。

pH试纸法：将pH值精密试纸的一端浸入被检肉浸出液中或直接贴在肉的新鲜切面上，数秒钟后取出与标准色板比较，直接读取pH值的近似数值。

酸度计法：将酸度计调零、校正、定位，然后将玻璃电极和参比电极插入容器内的肉浸液，按下读数开关，可直接从显示屏上读取该肉浸液的pH值。

（4）结果判定。新鲜肉：pH值为5.8～6.2；次鲜肉：pH值为6.3～6.6；变质肉：pH值为6.7以上。

三、实训报告

根据检样测定的方法、结果，对被检样品进行卫生评价。

作 业 单

一、名词解释

1．挥发性盐基氮　2．排酸值

二、填空

1．肉及肉制品的感官指标包括（　　）、（　　）、（　　）、（　　）等指标。

2．肉新鲜度的理化检验是根据肉中蛋白质等物质的分解产物，用（　　）和（　　）对肉的新鲜程度进行检验。

3．国家现行食品卫生标准中唯一的评定肉新鲜度的客观指标是测定肉中（　　）。

4．评定肉新鲜度其他方法如（　　）、（　　）、（　　）、（　　）、（　　）等常作为参考指标。

5．新鲜肉浸出液的pH值通常在（　　）范围。

6．测定肉pH值的方法，通常有（　　）和（　　）法。

7．宰后1 h的热鲜肉，其pH值可降到（　　），经24 h后降到（　　），此pH值在肉品加工中叫作“排酸值”。

评 估 单

【评估内容】

一、判断

1．我国现行法定肉新鲜度检验的理化指标是挥发性盐基氮。　　　（　　）

2．GB 5009.228—2016中挥发性盐基氮测定的第一种方法是微量扩散法。　　　（　　）

3．微量扩散法的原理是挥发性含氮物质可在37 ℃酸性溶液中释出，挥发后吸收于吸收液中，用标准酸溶液滴定，计算含量。　　　（　　）

4．健康家畜宰后pH值升高。　　　（　　）

5．肉腐败时，由于肉内蛋白质在细菌酶的作用下，被分解为氨和胺类化合物等碱性物质，因而使肉趋于碱性，pH值显著降低。　　　（　　）

6．新鲜肉pH值为5.8～6.2，次鲜肉pH值为6.3～6.6，变质肉的pH值为6.7以上。（　　）

7．GB 2707—2016规定鲜（冻）畜肉中挥发性盐基氮［mg/（100　g）］的含量≥15。　（　　）

8．大多数细菌及其内毒素都能升高肉类或被检肉浸出液的氧化还原势能。　　　（　　）

9．过氧化物酶只存在于健康动物的新鲜肉中，有病动物肉一般无过氧化物酶或者含量甚微。　　　（　　）

10．蛋白质和多肽类可与硫酸铜试剂中的Cu2+结合生成难溶于水的蛋白盐而沉淀下来，以此判定是否为有病动物肉。　　　（　　）

11．黄疸肉是由于机体发生大量溶血、全身性传染或某些中毒过程，胆绿素大量进入血液，将全身各组织染成黄色的结果。　　　（　　）

12．黄脂肉是由于饲料因素或遗传因素，使脂肪组织形成一种棕色或黄色的非饱和脂肪酸的叠合物小体使皮下或腹腔脂肪组织染成黄色。　　　（　　）

13．当存在胆红素时，上层乙醚液无色，下层液体染成黄绿色（由胆红素的水溶性钠盐生成），可判定为黄脂。　　　（　　）

14．上层乙醚液染成黄色，下层液体无色，可判定为黄脂。　　　（　　）

二、半微量定氮法测挥发性盐基氮操作

【评估方法】

（1）利用多媒体课件，分组对学生进行评估。

优：在限定的时间内完成全部判断，90%以上正确。

良：在限定的时间内完成全部判断，70%以上正确。

及格：延时完成全部判断，60%以上正确。

不及格：延时完成全部判断，40%以上不正确。

（2）半微量定氮法测挥发性盐基氮。

续表

为考核团队协作能力和互助学习精神，以小组为单位进行考核，每组随机抽查1人进行操作，以评价小组整体的动手操作能力。

备注：项目二十任务一学习情境占模块四总分的8%。