【基本概念】

志贺氏菌

【重点内容】

1．志贺氏菌检验的食品卫生学意义。

2．志贺氏菌检验程序。

【教学目标】

1．知识目标

熟悉志贺氏菌的特点，掌握志贺氏菌检验的食品卫生学意义。

2．技能目标

会进行志贺氏菌检验并根据国家标准判定结果，掌握志贺氏菌检验程序与基本操作技术。

资 料 单

一、志贺氏菌检验国家标准的适用范围

志贺氏菌检验国家标准适用于各类食品中志贺氏菌检验。

二、志贺氏菌的特点

1．形态特性

志贺氏菌为革兰氏阴性杆菌，与一般肠道杆菌无明显区别，不形成芽孢，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。

2．培养特性

需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适宜温度为37 ℃，最适宜pH值为6.4～7.8。在液体培养基中生长呈均匀浑浊，无菌膜形成。在普通培养基上经37 ℃培养24 h后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、边缘整齐，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。

3．生化特性

能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，VP试验阴性，甲基红阳性，不分解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。志贺氏菌属细菌对甘露醇分解能力不同，可分为两大组。

（1）分解甘露醇组。包括福氏菌、鲍氏菌和宋内氏菌，根据乳糖分解情况，分为迟缓分解乳糖的宋内氏菌和不分解乳糖的福氏菌和鲍氏菌，后者又根据能否产生靛基质，分为靛基质阳性菌（福氏菌1、2、3、4、5型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15型）和靛基质阴性菌（福氏菌6型，鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14型）两类。

（2）不分解甘露醇组。主要是志贺氏菌，根据能否产生靛基质，分为靛基质阴性（1、3、4、5、6、9、10型）和靛基质阳性（2、7、8型）志贺氏菌。

4．志贺氏菌的抗原构造与分型

志贺氏菌属细菌的抗原结构，由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。主要有三种抗原，即型特异性抗原、群特异性抗原、表面抗原（K抗原）。根据抗原构造的不同，将本属细菌分为4个群、39个血清型（包括亚型）。

三、志贺氏菌检验的食品卫生学意义

志贺氏菌属细菌常引起人的细菌性痢疾，是最常见的肠道传染病，主要由食物、饮水等经口感染。志贺氏菌所致菌痢的病情较重，有试验证明，10～200个细菌可使10%～50%志愿者致病。检测食品中的志贺氏菌可防止因志贺氏菌引起的食物中毒。

四、食品中志贺氏菌的检验方法

志贺氏菌检验时，先在鉴别培养基上挑选可疑菌落，经形态染色，并接种到三糖铁或双糖铁管，经37 ℃18～24 h培养并观察反应情况。凡三糖铁或双糖铁管中，生化反应可疑的，可进一步做血清学分型鉴定。必要时可做全面的生化反应鉴定。

技 能 单

一、原理

志贺氏菌属区别于肠杆菌科各属细菌最主要的特征为不运动，利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不形成可见气体，但志贺氏菌的进一步分群、分型有赖于血清学试验。

二、材料与设备

1．菌种

志贺氏菌、大肠埃希氏菌。

2．检样

肉制品。

3．培养基及试剂

培养基：GN增菌液、HE琼脂、SS琼脂、伊红美蓝琼脂（EMB）、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂（TSI）、葡萄糖半固体、苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶培养基、西蒙氏柠檬酸盐培养基、葡萄糖铵琼脂、尿素琼脂、氰化钾琼脂、氧化酶、糖发酵管（5%乳糖、甘露醇、棉籽糖、甘油、水杨苷、七叶苷）。

试剂：吲哚试剂、VP试剂、甲基红试剂、氧化酶试剂、志贺氏菌属诊断血清。

4．器具及其他用品

恒温箱、显微镜、灭菌广口瓶、灭菌三角瓶、灭菌平皿、载玻片、天平、乳钵、酒精灯、金属匙或玻璃棒、接种环、试管架、硝酸纤维素膜等。

三、流程

志贺氏菌检验操作流程如图3-19所示。

图3-19　志贺氏菌检验操作流程

四、方法与步骤

（一）增菌

称取检样25 g（25 mL），加入500 mL装有225 mL GN增菌液的广口瓶，于37 ℃培养6～8 h。固体食品用乳钵加灭菌砂磨碎或用均质器以8 000～10 000 r/min的转速打碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化。

（二）分离

取增菌液1环，划线接种于SS琼脂平板或HE琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板1个，于37 ℃培养24 h。同时应做大肠埃希氏菌的对照试验。志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。(www.daowen.com)

（三）生化试验

挑取平板上的可疑菌落，为防止遗漏，挑取菌落时一般应多挑几个，然后穿刺接种于三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。经37 ℃培养一段时间后，若三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸，不产气，斜面产碱，不产生H2S，半固体管内沿穿刺线生长，无动力，疑为志贺氏菌。若无此现象即志贺氏菌阴性。

若疑为志贺氏菌，即可做血清学试验。在做血清学试验的同时，应做苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、西蒙氏柠檬酸盐和葡萄糖铵、尿素、KCN、水杨苷、七叶苷试验等生化试验，志贺氏菌属均为阴性反应。必要时应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性反应的革兰氏阴性杆菌。

用生化试验方法做志贺氏菌四个生化群的鉴定，见表3-8。

表3-8　志贺氏菌属四个群的生化特性

（四）血清学分型

挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查。如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价血清和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。

五、实训报告

详细记录样品和对照菌种的各项结果，并给出结论报告，要求分析试验过程中存在的问题及解决办法。

备注：

1．GN增菌液

（1）成分：胰蛋白胨20 g，葡萄糖1 g，甘露醇2 g，柠檬酸钠5 g，去氧胆酸钠0.5 g，磷酸氢二钾4 g，磷酸二氢钾1.5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL。

（2）制法：按上述成分配好，加热溶解，调节pH值为7.0。分装每瓶225 mL，115 ℃高压灭菌15 min。

2．氧化酶试验

（1）试剂：1%盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制，干冰箱内避光保存。1%α-萘酚-乙醇溶液。

（2）试验方法：取白色洁净滤纸蘸取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深；再加α-萘酚-乙醇溶液一滴，阳性者于0.5 min内呈现鲜蓝色；阴性于2 min内不变色。

3．麦康凯琼脂

（1）成分：蛋白胨17 g，胨3 g，猪胆盐（或牛、羊胆盐）5 g，氯化钠5 g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL，乳糖10 g，0.01%结晶紫水溶液10 mL，0.5%中性红水溶液5 mL。

（2）制法：将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400 mL蒸馏水中，校正pH值为7.2。将琼脂加入600 mL加热溶解。将两液合并，分装后，121 ℃高压灭菌15 min。之后趁热加入乳糖，冷至50～55 ℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。

作 业 单

1．根据培养和生化试验，能否检出志贺氏菌?

2．志贺氏菌在普通琼脂平板上形成的菌落有哪些特点？

3．其他肠道致病菌如大肠杆菌在麦康凯琼脂平板、SS琼脂、伊红美蓝琼脂平板上形成什么样的菌落？

评 估 单

【评估内容】

一、填空

1．志贺氏菌属细菌的形态为革兰氏（　　）性杆菌。不形成芽孢，无荚膜，（　　）鞭毛，有菌毛。

2．志贺氏菌在液体培养基中生长呈（　　），无菌膜形成。

二、判断

1．志贺氏菌不能分解葡萄糖，分解尿素，不产生H2S。　　　（　　）

2．志贺氏菌在麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板上应形成无色透明不发酵乳糖的菌落。　　　（　　）

3．志贺氏菌在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸，不产气，斜面产碱，不产生H2S。　（　　）

三、简答

1．简述志贺氏菌检验的食品卫生学意义。2．如何检出食品中的志贺氏菌？

四、操作

各小组进行肉制品中志贺氏菌的检验，并写出检验报告。

续表

【评估方法】

以小组为单位进行评估。主要是在试验过程中进行，检查各小组是否掌握了志贺氏菌检验的方法和步骤，同时对各小组人员随机抽取2人进行提问，提问分数以2人平均分数计。

优：小组能独立正确地完成各项工作，并能正确回答问题。

良：小组能独立正确地完成大部分工作，个别环节仍需提示才能完成。

及格：小组能基本完成大部分工作，其他环节有错误。

不及格：小组不能独立完成各项工作，没有试验现象。

备注：项目十七任务五学习情境占模块三总分的6%。