【基本概念】

沙门氏菌

【重点内容】

1．沙门氏菌检验的食品卫生学意义。2．沙门氏菌检验程序。

【教学目标】

1．知识目标

熟悉沙门氏菌的特点，掌握沙门氏菌检验的食品卫生学意义。2．技能目标

会进行沙门氏菌检验并根据国家标准判定结果。

资 料 单

一、沙门氏菌检验国家标准的适用范围

沙门氏菌检验国家标准适用于各类食品和食物中毒样品中沙门氏菌的检验。

二、沙门氏菌的特点

形态特征：沙门氏菌属肠杆菌科，为革兰氏阴性无芽孢杆菌。菌体大小为（0.6～0.9）μm× （1～3）μm，一般无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，大多有周身鞭毛。

培养特性：营养要求不高，分离培养常采用肠道选择鉴别培养基。

生化反应：不液化明胶，不分解尿素，不产生吲哚，不发酵乳糖和蔗糖，能发酵葡萄糖、甘露醇、麦芽糖，大多产酸产气，少数只产酸不产气；大部分沙门氏菌在三糖铁琼脂上常产生H2S，能使赖氨酸和鸟氨酸脱羧基；VP试验阴性，生化反应对本属菌的鉴别具有重要参考意义。

三、沙门氏菌检验的食品卫生学意义

沙门氏菌属是一大群寄生于人类和动物肠道，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。沙门氏菌病常在动物中广泛传播，人的沙门氏菌感染和带菌非常普遍，主要引起人类伤寒、副伤寒及食物中毒或败血症。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常居首位或第二位。污染源主要是人和家畜的粪便，沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类和猪中最常见，在许多环境中也有存在。检测食品中沙门氏菌可防止因沙门氏菌引起的食物中毒。

四、食品中沙门氏菌的检验方法

食品中沙门氏菌的检验有五个基本步骤。

（1）前增菌，用无选择性的培养基使处于濒死状态的沙门氏菌恢复活力。

（2）选择性增菌，使沙门氏菌得以繁殖，而大多数的其他细菌受到抑制。

（3）分离培养，选择性平板分离沙门氏菌。

（4）生化试验，鉴定到属。

（5）血清学分型鉴定。

目前食品中沙门氏菌的检验是以统计学取样方案为基础、25 g食品为标准分析单位。

技 能 单

一、材料与设备

1．菌种

沙门氏菌、大肠埃希氏菌。

2．检样

冻肉、蛋品、乳品等。

3．培养基

缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋琼脂（BS）、HE琼脂、蛋白胨水、三糖铁高层琼脂斜面、尿素培养基、氰化钾培养基、水杨苷培养基、鸟氨酸脱羧酶试验培养基、ONPG培养基、棉籽糖培养基、甘露醇培养基、山梨醇培养基。

4．试剂

吲哚试剂、VP试剂、甲基红试剂、氧化酶试剂、革兰氏染色液等。

5．器具及其他用品

天平、三角烧瓶、吸管、平皿、均质器或乳钵、显微镜、广口瓶、金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架。

二、流程

沙门氏菌检验操作流程如图3-18所示。

三、方法与步骤

（一）前增菌

各 取 检 样25 g，加 入 盛有225 mL灭菌缓冲蛋白胨水的500 mL广口瓶（瓶内预放玻璃珠若干粒），塞紧瓶口，充分摇匀，放入37 ℃环境培养4 h。固体食品应先用均质器以 8 000～10 000 r/min的转速打碎，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使之乳化。

图3-18　沙门氏菌检验操作流程

（二）选择性增菌

将增菌培养物移出1 mL，加入10 mL四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液中，在42 ℃培养18～24 h。另取增菌培养物1 mL，加入10 mL亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液内，在（36±1）℃培养18～24 h。

（三）分离培养

取增菌液1环，分别划线接种于1个BS平板和1个HE平板。BS平板于37 ℃培养40～ 48 h，HE平板于37 ℃培养18～24 h。观察各个平板上生长的菌落，挑取平板深色或深色有光泽等特征的可疑菌落进行革兰氏染色与镜检。

判定：典型沙门氏菌在BS琼脂上，产硫化氢的菌落为黑色，有时带有金属光泽，呈褐色、灰色或黑色。菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有所谓的晕环效应。典型沙门氏菌在HE琼脂上，菌落呈蓝绿至蓝色，带或不带黑色中心，许多沙门氏菌培养物可呈现大的有光泽的黑色中心或几乎全部黑色的菌落。

（四）生化试验

生化试验主要用于属种鉴定。方法如下：

将上述革兰氏阴性杆菌的可疑菌落，挑取数个接种于1支三糖铁高层琼脂斜面，先在斜面上划线，再于底层穿刺。同时接种于蛋白胨水（供做靛基质试验）、氰化钾（KCN）培养基、尿素琼脂（pH值7.2）、赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管，于（36±1）℃培养18～24 h，必要时可延长48 h。

判定：

（1）根据三糖铁高层琼脂斜面的反应结果判断是否为可疑沙门氏菌，按表3-3进行判定。

表3-3　肠杆菌科各属在三糖铁高层琼脂内的反应结果

在三糖铁高层琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢（H2S）阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时均有不是沙门氏菌的可能。

（2）按表3-4的判定结果，沙门氏菌属五项生化试验的结果应符合A1、A2和B1，其他反应结果均可以排除。

表3-4　沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

①符合反应序号A1，为沙门氏菌属典型反应，判定为沙门氏菌属细菌。若尿素琼脂、氰化钾、赖氨酸试验三项中，有一项异常，按表3-5可判定沙门氏菌。

表3-5　反应序号A1沙门氏菌属判定

②符合反应序号A2，可先做血清学鉴定，如A～F多价O血清不凝聚时，补做甘露醇和山梨醇试验，按表3-6判定结果。

表3-6　 反应序号A2沙门氏菌属判定

③符合反应序号B1，三糖高层斜面产酸的菌株可以排除，不产酸的应该先做血清学鉴定。如A～F多价O血清不凝聚时，补做鸟氨酸、ONPG、水杨苷、棉籽糖和半动力试验，按表3-7判定结果。

表3-7　反应序号B1沙门氏菌属判定

（五）血清学分型鉴定(www.daowen.com)

因在实际工作中用得较少，故在实习中略去此步骤。

四、实训报告

综合以上生化试验鉴定结果，写出实训报告。

备注：

1．缓冲蛋白胨水（BPW）

（1）成分：蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，磷酸氢二钠（含12个结晶水）9.0 g，磷酸二氢钾 1.5 g，蒸馏水1 000 mL。

（2）制法：将各成分加入蒸馏水，搅匀并煮沸溶解，调节pH值至7.2±0.2，高压灭菌

121 ℃，15 min。

2．亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液

（1）成分：蛋白胨5.0 g，乳糖4.0 g，磷酸氢二钠10.0 g，亚硒酸氢钠4.0 g，L-胱氨酸0.01 g，蒸馏水1 000 mL。

（2）制法：除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水，煮沸溶解，冷至55 ℃以下，再以无菌操作加入亚硒酸氢钠和 1 g/L的L-胱氨酸溶液10 mL，摇匀，调节pH值至7.0±0.2。

3．亚硫酸铋琼脂（BS）

（1）成分：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏5.0 g，葡萄糖 5.0 g，硫酸亚铁0.3 g，磷酸氢二钠 4.0 g，柠檬酸铋铵 2.0 g，亚硫酸钠 6.0 g，琼脂18.0～20 g，煌绿0.025 g，蒸馏水1 000 mL。

（2）制法：将蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖加入300 mL蒸馏水制作基础液，将硫酸亚铁、磷酸氢二钠、柠檬酸铋铵和亚硫酸钠、琼脂分别加入20 mL、30 mL、20 mL和30 mL、 600 mL蒸馏水，然后分别搅匀后煮沸溶解，冷至80 ℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠溶液混合后倒入基础液，混匀，然后将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠溶液混合后倒入基础液，再混匀。调节pH值至7.5±0.2，随即将混合液倾入琼脂液，混匀，冷至50 ℃～55 ℃，加入煌绿充分混匀，立即倾注平皿。

4．三糖铁琼脂（TSI）

（1）成分：蛋白胨20.0 g，牛肉膏5.0 g，乳糖10.0 g，蔗糖10.0 g，葡萄糖1.0 g，硫酸亚铁铵（含6 个结晶水）0.2 g，酚红0.25 g，氯化钠5.0 g，硫代硫酸钠0.2 g，琼脂12.0 g，蒸馏水1 000 mL。

（2）制法：除酚红和琼脂外，将其他成分加入400 mL蒸馏水，煮沸溶解调节pH值至7.4±0.2。另将琼脂加入600 mL蒸馏水，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入酚红指示剂，混匀，分装，高压灭菌121 ℃ 10 min 或 115 ℃ 15 min。

5．蛋白胨水

（1）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20.0 g，氯化钠5.0 g，蒸馏水1 000 mL。

（2）制法：将上述成分加入蒸馏水，煮沸溶解，调节pH值至7.4±0.2，分装小试管，121 ℃高压灭菌 15 min。

6．尿素琼脂（pH值7.2）

（1）成分：蛋白胨1.0 g，葡萄糖1.0 g，磷酸二氢钾2.0 g，0.4%酚红3.0 mL，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL，20%尿素溶液100 mL。

（2）制法：除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入蒸馏水，煮沸溶解并调节pH值至7.2±0.2，然后加入酚红再分装，于121℃高压灭菌15 min。冷至50～55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液，制成斜面。

7．氰化钾（KCN）培养基

（1）成分：蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，磷酸二氢钾0.225 g，磷酸氢二钠5.64 g，蒸馏水 1 000 mL，0.5%氰化钾20.0 mL。

（2）制法：将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水，煮沸溶解，分装后121 ℃高压灭菌 15 min。冷却后加入0.5%氰化钾溶液，分装于无菌试管。

8．赖氨酸脱羧酶试验培养基

（1）成分：蛋白胨5.0 g，酵母浸膏3.0 g，葡萄糖1.0 g，1.6%溴甲酚紫—乙醇溶液 1.0 mL，L-赖氨酸5 g，蒸馏水1 000 mL。

（2）制法：将除赖氨酸以外的成分加入蒸馏水，加热溶解，加入赖氨酸，混匀，调节pH值至6.8±0.2，每瓶分装100 mL，于115 ℃高压灭菌10 min。

作 业 单

1．如何提高沙门氏菌的检出率?

2．沙门氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何?

3．食品中是否允许有个别沙门氏菌存在?为什么?4．典型沙门氏菌在亚硫酸铋琼脂（BS）上形成什么样的菌落?

评 估 单

【评估内容】

一、填空

1．一般样品前增菌时间为（　　）h，干蛋品一般为（　　）h。

2．沙门氏菌检验选择性增菌时，常用的增菌液有（　　）、（　　）、（　　）等。

二、判断

1．前增菌目的是用无选择性的培养基使处于濒死状态的沙门氏菌恢复其活力。　（　　）

2．前增菌时间不宜太长，一般为8 h，否则会有杂菌生长。　　　（　　）

三、简答

1．简述沙门氏菌检验的食品卫生学意义、沙门氏菌的特点。

2．沙门氏菌检验有哪五个基本步骤？

3．选择性增菌的目的是什么？

4．典型沙门氏菌在HE琼脂上形成什么样的菌落?

四、操作

进行乳品中的沙门氏菌检验，并写出检验报告。

续表

【评估方法】

以小组为单位进行评估。主要是在试验过程中进行，检查各小组是否掌握了沙门氏菌的增菌及检查方法，同时对各小组人员随机抽取2人进行提问，提问分数以2人平均分数计。

优：小组能独立正确完成各项工作，并正确回答问题。

良：小组能独立正确完成大部分工作，个别环节仍需提示才能完成。

及格：小组能基本完成大部分工作，其他环节有错误。

不及格：小组不能独立完成各项工作。

备注：项目十七任务四学习情境占模块三总分的12%。