【基本概念】

复合染料

【重点内容】

染色的方法及其基本过程。

【教学目标】

1．知识目标

知道常用细菌染色的染料，并掌握常规染色方法。

2．技能目标

掌握染色的基本操作过程，明白各过程在染色当中所起的作用。

资 料 单

一、细菌的染色

（一）细菌染色的染料

1．酸性染料

酸性染料又称阴离子染料，酸性染料染色离子带阴性，如伊红、刚果红等。酸性染料能与带阳性离子的物质结合，使之着色。若降低菌液的pH值而使细菌带阳性离子，就可用酸性染料染色。

2．碱性染料

碱性染料又称阳离子染料，碱性染料染色离子带阳性，如亚甲蓝、碱性复红等。碱性染料能与带阴性离子的物质结合。细菌一般带阴性离子，所以常用碱性染料进行染色。

3．复合染料

复合染料又称中性染料，即碱性染料与酸性染料的结合物，如Wright染料中的伊红美蓝，Giemsa染料中的伊红天青等。

4．单纯染料

单纯染料的染色能力视其能否溶于被染物质而定，这种染料大多属于偶氮化合物，能溶于脂溶性溶剂，但不溶于水，如苏丹类染料。

（二）影响染色的因素

影响染色的因素主要有染色液中电解质含量、pH值、温度、细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构的完整性。此外，培养基的组成、菌龄、药物的作用等，都能影响细菌的染色情况。

二、细菌染色的基本方法和步骤

（一）细菌染色的基本方法

1．单染色法

单染色法是指只用一种染料染色，各种细菌均染成同一种颜色，如用亚甲蓝或稀释石炭酸复红等染色的方法。用此方法染色后只能显示细菌的形态大小，但对细菌的鉴别价值不大。

2．复染色法

复染色法又称鉴别染色法，是指用两种或两种以上染料染色的方法。用此方法染色细菌之后，既能显示细菌的形态大小，又对细菌种类有一定的鉴别作用。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸染色法。

3．细菌特殊结构的染色法

此方法能使细菌的特殊结构着色成与菌体不同的颜色，有利于检查细菌的特殊结构，以鉴别细菌。在细菌检查中，异染颗粒染色法较常应用，其他特殊结构染色法因操作费时，在日常检验工作中较少使用。

4．荧光染色法

除上述染色法外，还有用金胺、吖啶橙等荧光染料进行染色的方法。此类染料可溶于水，在紫外线照射下能激发出荧光，也可分为酸性染料及碱性染料两种。荧光染料染色后可以在荧光显微镜下看到黑背景中细菌发出的明亮荧光。荧光染色法有加快检查速度和提高阳性率的优点。

（二）细菌染色的基本步骤

1．涂片

取洁净的玻片一张，接种环灭菌后取1～2环无菌生理盐水放于载玻片的中央，再将接种环灭菌后从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，做成直径1　cm左右的涂圈。若为液体标本，直接用接种环蘸取液体涂抹即可。若为多个标本而行同一染色时，可事先用记号笔在玻片上划分数格，并于玻片的背面标明编号。

2．干燥

可采用室温自然干燥。若需加速干燥，可在火焰上方的热空气中加温干燥，但时间不宜太长，避免烤枯标本，影响检视。

3．固定

固定法主要有火焰固定法和化学固定法两种。一般均采用火焰固定法，即将涂片迅速通过火焰2～3次，以玻片反面触及皮肤热而不烫为度。化学固定法常采用甲醇固定，即将适量的甲醇滴加于已干燥好的涂片上，3～5 min后水洗。

固定可以使细菌的细胞质蛋白凝固，菌体较牢地黏附于玻片；此外，固定可以改变菌体对染料的通透性。

4．染色

（1）初染。将涂片置于染色架上，滴加染液以覆盖标本，一定时间后冲洗。

（2）媒染。在已初染的标本片上滴加染液，一定时间后冲洗。主要用于增强菌体与染液间的作用力。常用的媒染液有金属盐、碘液等。

（3）脱色。在已媒染的标本片上滴加染液，一定时间后冲洗。其目的在于测知染料与被染物之间结合的牢固程度，一般用的脱色剂是酒精、酸等。

（4）复染。目的是使已脱色的菌体重新染色，并与前染液颜色呈鲜明的对比。

5．染色标本的保存与封片

观察细菌染色标本需用油镜，观察后应用擦镜纸将标本上的镜油轻轻吸去，可短期保存于标本盒。若要长期保留，应在标本中央滴一滴加拿大树胶，并覆盖一洁净盖玻片，自然干燥，可多年保存于玻片盒。

技 能 单

一、材料与设备

酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、亚甲蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油等。

二、流程

涂片→干燥→固定→细菌染色。

三、方法与步骤

（一）涂片

1．固体培养物

取洁净的玻片一张，接种环灭菌后取1～2环无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌后从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，做成直径1　cm左右的涂面。

2．液体培养物

用灭菌接种环蘸取细菌培养液1～2环，直接在玻片上做成涂面。(www.daowen.com)

3．液体病料

取一张玻片，用其一端蘸取所检液体材料（如血液、腹水等）少许，在另一张洁净的玻片上，以45°均匀推成一薄层的涂面。

4．组织病料

以无菌剪刀、镊子剪取组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做几个薄层压印。

无论何种方法，切忌涂抹太厚，否则不利于细菌染色和观察。涂片制作步骤如　图3-15所示。

图3-15　涂片制作步骤

（二）干燥

室温自然干燥或在火焰上方的热空气中加温干燥。

（三）固定

一般均用火焰固定法，将涂片迅速通过火焰2～3次，以玻片反面触及皮肤，热而不烫为度。

（四）细菌染色

1．革兰氏染色法

（1）在固定好的涂片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，染2 min左右，水洗。

（2）加革兰氏碘液媒染，作用2 min，水洗。

（3）加95%酒精脱色15～30 s，水洗。

（4）加稀释石炭酸复红或沙黄水溶液复染2 min左右，水洗，用吸水纸吸干后镜检。结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

2．亚甲蓝染色法

在固定好的涂片上，滴加适量亚甲蓝染色液，染色2～3 min，水洗，晾干或用吸水纸轻压吸干后镜检。

结果：菌体呈蓝色。

3．瑞氏染色法

在固定好的涂片上，滴加瑞氏染色液，2 min左右，再滴加与染色液等量的磷酸盐缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃与染色液混合均匀，5 min左右水洗，晾干或用吸水纸轻压吸干后镜检。

结果：菌体呈蓝色，组织细胞的胞浆呈红色，细胞核呈蓝色。

4．吉姆萨染色法

血片或组织触片用甲醇固定干燥后，在其上滴加足量吉姆萨染色液，染色30 min，水洗，吸干或烘干，镜检。

结果：细菌呈蓝青色，细胞质呈红色，细胞核呈蓝色。

四、实训报告

根据试验写出实训报告，并画出显微镜中观察到的细菌特征，包括形态、颜色等。

作 业 单

一、名词解释

复染色法

二、判断

1．细菌标本火焰固定时，越烫，固定效果越好。（　　）

2．标本片镜检后，应马上用擦镜纸将油擦干净后装入标本盒。（　　）

三、简答

1．除了革兰氏染色法，常用的染色方法还有哪些？各种染色方法会使细菌染成什么颜色？

2．为什么革兰氏染色后阳性菌呈蓝紫色、阴性菌呈红色？

3．革兰氏染色法中酒精脱色的目的是什么？

评 估 单

【评估内容】

一、填空

1．细菌染色基本方法有单染色法、（　　）、（　　）、荧光染色法。

2．细菌染色的染料有（　　）、（　　）、（　　）、（　　）。

3．固定的方法有（　　）、（　　），一般均用（　　）。

4．常用的复染色法有（　　）、（　　）。

二、简答

1．简述不同材料涂片的方法。

2．简述革兰氏染色法步骤。

三、操作

各小组对已在平板上培养出的细菌进行涂片染色镜检，并观察染色结果。

【评估方法】

以小组为单位进行评估。主要是在试验过程中进行，检查各小组是否掌握细菌涂片染色镜检操作步骤，同时对各小组人员随机抽取2人进行提问，提问分数以2人平均分数计。

优：小组能独立正确地完成各项工作，并能正确回答问题。

良：小组能独立正确地完成大部分工作，个别环节仍需提示才能完成。

及格：小组能基本完成大部分工作，其他环节有错误。

不及格：小组不能独立完成各项工作，没有试验现象。

备注：项目十六任务六学习情境占模块三总分的6%。