【基本概念】

菌落、菌苔、分离培养

【重点内容】

分离培养的基本要领和方法。

【教学目标】

1.知识目标

熟悉细菌的分离培养技术，掌握分离培养的基本要领和方法。

2.技能目标

掌握斜面接种的方法并会进行细菌菌种的保存。

资 料 单

一、细菌的接种

细菌的接种和培养是微生物检验中不可缺少的操作过程。例如，有些时候样品中细菌较少，不易检出，此时需要通过增菌培养的方法培养出更多的细菌来进行检验，即将样品接种在液体培养基内，使细菌在其中生长繁殖，再进一步分离和鉴定；再者，很多时候有些标本中除含有数量较少的致病菌外，常含有更多的非致病菌及杂菌，此时就需要通过分离培养法来分离病原菌，进行下一步试验。

细菌的接种是通过接种环蘸取细菌或样品标本来进行的。右手以持笔式握住接种环，左手持培养基配合操作。接种程序：接种环灭菌→待冷→蘸取细菌或标本→进行接种（启盖或塞、接种划线、加盖或塞）→灭菌接种环。不同培养基的接种方法如下。

（一）平板划线接种法

平板划线接种法又称分离培养法，其目的是将混有多种细菌的培养物或样品标本于平板培养基上接种划线，使其分散生长，最终形成单个菌落或分离出单一菌株，从而有利于各种细菌的识别鉴定。

细菌接种于平板培养基上在一定条件下经一定时间培养形成的肉眼可见的单个细菌集团，称为菌落。因细菌的种类和所用培养基不同，形成的菌落形状、色泽、大小、透明度、边缘隆起度、湿润度、溶血现象等都有差异，这些差异可以作为识别细菌的重要依据。有些时候细菌在固体培养基表面生长密集，未能形成单个菌落，而形成了肉眼可见的细菌堆积物，称为菌苔。

平板划线接种法是细菌分离培养的常用技术，划线方法较多，以分段划线法与曲线划线法较为常用。

1．分段划线法

方法是以接种环蘸取少许标本，先涂布于平板培养基表面一角作为第一段划线，划线时接种环与培养基表面约呈45°，划线完毕后取出接种环置于火焰上灭菌，待冷却后，打开皿盖进行第二段划线，方法是与第一段所划的线相交接数次后不再相交划出第二个区域，完毕后再如上法灭菌，接种划线，依次划至最后一个区域。需要注意的是：最后一个区域的划线不得与第一段划线相接，划线完毕，最后灭菌接种环，盖好平皿盖，倒置于37 ℃恒温箱中培养。分段划线法中每一段划线内的细菌数逐渐减少，这种划线法划线越长形成单个菌落的可能性越大。本方法多用于含菌量较多的标本。分段划线法如图3-10所示。

2．曲线划线法

方法是用接种环将标本或培养物涂于平板培养基表面的一角，然后接种环自标本涂擦处开始，连续向左、右两侧划开并逐渐向下移动，划成若干条分散的曲线。此方法多用于接种材料中含菌数量不太多的标本或培养物。曲线划线法如图　3-11所示。

图3-10　分段划线法

图3-11　曲线划线法

（二）斜面接种法

斜面接种法是指从平板培养物上挑取一个菌落，移接至斜面培养基上的方法。此种方法主要用于接种纯菌，使其增殖后用于鉴定或保存菌种。步骤如下：

左手持培养基，右手持接种环，将接种环通过火焰灭菌冷却后，左手打开培养皿盖，右手挑取菌落；之后左手立即换取斜面培养基管，并以持接种环的右手小指和无名指夹住试管棉塞，转动后拔出并夹持于手指间；立即将管口通过火焰灭菌后将接种环伸入斜面管，从斜面底部至顶端作Z形划线。

（三）穿刺接种法

过程类似斜面接种法，不同之处在于穿刺接种法是由斜面培养基表面中央直刺至底部，然后沿穿刺线拔出接种针即可。此方法多用于半固体、明胶、双糖等培养基的接种。穿刺接种法如图3-12所示。

图3-12　穿刺接种法

（四）液体接种法

接种过程与斜面接种法基本相似，不同之处在于液体接种法是将挑取的菌落或菌液直接接种于液体培养基内。此方法多用于营养肉汤、单糖发酵试验等。

（五）倾注培养法

方法是取原始液体标本或经适当稀释的标本1 mL，置于直径9 cm无菌平皿，倾入已溶化的培养基13～15 mL即可。但应注意倾入的培养基应冷却至50 ℃左右，倾入后立即混匀待凝固后倒置于37 ℃恒温箱中培养18～24 h。本方法既适用于液体标本的细菌计数，也适用于厌氧菌的培养。

二、接种环使用注意事项

（1）接种环使用前后均需在酒精灯火焰上彻底烧灼一次，金属棒部分也需转动通过火焰灼烧。

（2）接种环经火焰灭菌，需待冷却后再蘸取标本或放置于工作台上，以防烫死微生物或烧损桌面。在固体培养基上接种时，可接触培养基表面试之，若不溶化琼脂，即说明接种环已冷却。

（3）接种环使用后，其上可能带有残余菌液，尤其是液体培养物接种后，残余菌液更多，若此时直接将环烧灼，则环上残余菌液可因突受高热，暴烈四溅，有传染危险。因此用后的接种环应先将近环处镍丝置于火焰中，使热导向接种环，待环上菌液渐渐蒸发干涸后，再将接种环以垂直方向于火焰中烧红灭菌（图3-13）。

图3-13　接种环火焰灭菌

三、细菌的培养方法

不同的细菌标本和不同的培养目的需要用不同的培养方法，常用的培养方法有一般培养法、二氧化碳培养法及厌氧培养法。

（一）一般培养法

一般培养法又称为需氧培养法，即将已接种好细菌的培养基，如平板划线的培养基、斜面、液体接种的培养基等，置于37 ℃恒温箱中培养18～24 h，一般细菌即可于培养基上生长。

（二）二氧化碳培养法

二氧化碳培养法是指将某些细菌置于二氧化碳环境中进行培养的方法，这样的细菌有脑膜炎球菌、布鲁氏杆菌等。常用的二氧化碳培养法有烛缸法和化学法。

1．烛缸法

将已接种好细菌的培养基，置于磨口标本缸或干燥器内，并在缸内或干燥器内放入小段点燃的蜡烛，勿靠近缸壁中，以免烤热缸壁而炸裂。缸盖及缸口涂以凡士林，盖密缸盖。燃烛自行熄灭时，容器内含二氧化碳5%～10%。最后连同容器一并置于37 ℃恒温箱中培养。

2．化学法

化学法又称碳酸氢钠-盐酸法，即按每升容积加入0.4 g碳酸氢钠、0.35 mL浓盐酸的比例，将两药分开置于容器中，然后连同容器置于含有细菌培养基的标本缸或干燥器内，密闭标本缸或干燥器，将标本缸或干燥器稍倾斜，使盐酸与碳酸氢钠接触而生成二氧化碳。

（三）厌氧培养法

实验室常用的厌氧培养法有下列四种。

1．肉渣（腐肉）培养法

肉渣（腐肉）培养法又称动物组织耗氧法。因肉渣中含有不饱和脂肪酸，经肉中酶作用后，能吸收环境中的氧气；肉渣中还含有谷胱甘肽，用于降低环境中的氧化势能；加之培养基的液面用凡士林封闭而造成缺氧的状态。

2．焦性没食子酸法

焦性没食子酸在碱性溶液中能形成可吸收空气中氧气的焦性没食子橙，从而造成缺氧环境。

3．硫乙醇酸钠法

用还原剂硫乙醇酸钠除去培养基中的氧气或氧化型物质，形成厌氧环境或降低氧化还原势能，利于厌氧菌的生长。

4．厌氧罐法

将培养物放入特制的厌氧罐，先通以氢气，然后通电，经铂或银的触媒作用，使氢与氧燃烧而消耗氧气，造成缺氧环境。

四、细菌的生长现象

不同种类的细菌在培养基中的生长现象也会不同，各种生长现象有助于鉴别细菌。

（一）细菌在液体培养基中的生长现象

1．浑浊

细菌在液体培养基中呈现均匀弥漫生长，形成不同程度的肉眼可见的浑浊。大部分细菌的生长呈浑浊现象。

2．沉淀

细菌由于重力而下沉，管底出现肉眼可见的沉淀物，但沉淀物上面的液体仍清澈透明，如链球菌的链与链互相缠绕而下沉。

3．菌膜

某些细菌易在液体表面生长，因而可在液体表面形成肉眼可见的薄膜，称之为菌膜，如霍乱弧菌在液体培养基内可形成菌膜。

（二）细菌在半固体培养基中的生长现象

无鞭毛的细菌，因为没有运动性，所以只会沿穿刺线生长；有鞭毛的细菌，除沿穿刺线生长外，还可沿穿刺线向外扩散生长，呈倒立的松树状。因此，穿刺法可以用于鉴别细菌是否具有鞭毛、是否具有运动性。

应当指出的是，在进行细菌的培养检查时，应根据参考标本来源和送检目的，选用适当的培养基和培养条件才能获得可靠的结果。

五、菌种的保管要求(www.daowen.com)

（1）菌种的保存常采用半固体穿刺法或琼脂斜面接种法，必要时加入适量灭菌液体石蜡或半固体琼脂，然后用固体石蜡封管并置于4 ℃冰箱保存。如用冷冻真空干燥保存，可长期保存。

（2）所保存的菌株应有菌种名称、分离日期、分离来源、传代日期、保存方法、主要性状、保管者等项目的登记。

（3）菌种应设专人妥善保管，最好加锁并放于安全的环境，取出时应进行登记，转让时应有转让手续。

（4）保存的菌株要3～6个月传代一次，传代时要注意无菌操作，不能使菌株死亡，更不能污染菌株。

（5）菌种经传代数次后，应检查其是否发生变异，即系统地进行一次生化反应试验及血清学特性、毒力测定等主要生物学性状观察。

技 能 单

一、材料与设备

生化培养箱、平板培养基、斜面培养基、接种环、菌种、病料、肉渣（腐肉）培养基、接种环、酒精灯、烙刀、镊子、剪子等。

二、流程

分离培养→细菌移植→穿刺接种。

三、方法与步骤

（一）细菌的分离培养

平板划线接种法具体操作步骤如下。

1．接种环灭菌

右手持接种环经过火焰灼烧灭菌。

2．无菌条件下取病料

液体病料可用接种环直接挑取一环；固体病料用无菌剪刀或烙刀在病料表面做一切口，然后用灭菌接种环从切口插入组织，缓缓转动接种环，取少量组织或液体。

3．打开培养皿盖

左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧。

4．划线

将已取到被检材料的接种环伸入平皿，并涂于培养基一侧，然后以腕力在培养基表面轻轻地分区划线。

5．结束

划线完毕，烧灼接种环，盖好培养皿并做好标记，倒置于37 ℃恒温箱，培养18～24 h，观察结果。

（二）细菌移植

斜面移植操作步骤如图3-14所示。

（1）左手持菌种管及琼脂斜面管，斜面管放在内侧，菌种管放在外侧，两管口齐平，管身略倾斜，培养基斜面向上，管口靠近酒精灯。

（2）拔出试管塞。以持接种环的右手小指和无名指夹住试管棉塞，转动后拔出并夹持于手指间。

（3）接种。立即将管口通过火焰灭菌，接种环伸入菌种管，取上细菌后马上移入斜面管，并从底部到顶端呈Z形划线。

（4）划线完毕后，塞好塞子，接种环灭菌，接好的试管置于37 ℃恒温箱培养。

图3-14　斜面移植操作步骤

（杜鹏：《乳品微生物学实验技术》，2008年）　（a）接种环灭菌；（b）开启棉塞；（c）管口灭菌；　（d）挑取细菌；（e）移植；（f）塞好棉塞

四、实训报告

根据所做试验写出实训报告及体会，并描述所接种细菌的菌落特征，同时分析试验过程中存在的问题及原因。

作 业 单

一、填空

1．二氧化碳培养法有（　　）、（　　）。

2．穿刺接种法多用于（　　）、（　　）、（　　）等培养基的接种。

3．细菌在液体培养基中生长能见到的现象是（　　）、（　　）、（　　）。

4．保存的菌株要（　　）个月传代一次。

二、简答

1．细菌倾注培养法的操作步骤及方法，主要用于什么细菌的培养？

2．如何进行厌氧菌的培养？

3．简述细菌接种程序。

4．平板划线有什么用途？

评 估 单

【评估内容】

一、名词解释

1．菌落　2．菌苔

二、判断

1．斜面移植时，可在接种环火焰灭菌后马上挑取菌落进行接种。　　　（　　）

2．链球菌在肉汤培养基中生长呈沉淀现象。　　　（　　）

3．霍乱弧菌在液体培养基内可形成菌膜。　　　（　　）

三、简答

1．简述平板划线接种法的步骤。

2．接种环使用后若留有残余菌液较多时应如何灭菌？

3．穿刺接种法与斜面接种法的不同之处在哪里？

四、操作

各小组进行细菌平板划线、斜面移植等操作，并在培养后观察形成菌落的情况。

【评估方法】

以小组为单位进行评估。主要是在试验过程中进行，检查各小组是否掌握平板划线、斜面移植等操作步骤和方法，同时对各小组人员随机抽取2人进行提问，提问分数以2人平均分数计。

优：小组能独立正确地完成各项工作，菌落形成较多。

良：小组能独立正确地完成大部分工作，个别环节仍需提示才能完成，有菌落形成。

及格：小组能基本完成大部分工作，其他环节有错误，能看到有细菌生长。

不及格：小组不能独立完成各项工作，没有试验现象。

备注：项目十六任务五学习情境占模块三总分的6%。