【基本概念】

培养基、基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基

【重点内容】

培养基制备的原则和制备的程序。

【教学目标】

1．知识目标

熟悉培养基的种类；知道细菌培养生长所需的条件，并掌握培养基制备的原则和制备的程序。

2．技能目标

会进行各种培养基的制备；掌握常用培养基（普通肉汤、普通琼脂）的制备方法。

资 料 单

一、细菌培养（生长）条件

1．营养物质

营养物质是细菌生长过程中不可缺少的物质，主要有碳源、氮源、无机盐、生长素及水分等。

2．酸碱度

酸碱度对细菌的生长繁殖影响很大。大多数病原菌最适宜的酸碱度pH值为7.2～7.6，个别嗜碱性细菌如霍乱弧菌在pH值8.4～9.2环境中生长，结核分枝杆菌则在微酸性　pH值6.5～6.8环境中有较好的生长。有时在制备培养基时，营养物中要加入缓冲剂磷酸氢二钠和磷酸二氢钾等，因为许多细菌在培养过程中因分解糖类而产酸，影响了本身的生长。

3．温度

大多数病原菌适应了人的体温，其最适宜的生长温度为37 ℃。低温能使细菌的生长减慢或相对静止，高温则有抑制或杀灭细菌的作用。

4．气体

有的细菌（如牛布鲁氏杆菌）在初分离时，必须在培养环境中增加5%～10%的二氧化碳才能生长。

5．湿度和渗透压

细菌生长需要一定的湿度和渗透压，干燥环境可使细菌生长受阻。

6．光线

日光与紫外线均有杀菌力，因此，细菌培养物应放在暗处进行培养。

二、培养基及其种类

以人工的方法将细菌所需要的各种营养物质按一定的比例合理地配合在一起所形成的营养基质称为培养基。培养基能为细菌生长繁殖提供必要而充分的营养，如水分、碳源、氮源、无机盐和维生素等。不同的细菌有不同的营养要求，所需要培养基的种类也不同。培养基按其作用可分为基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴定培养基及厌氧培养基等；按其物理性状可分为固体、半固体及液体培养基；按其组成成分可分为非合成、半合成及合成培养基。

1．基础培养基

含有细菌需要的最基本的营养成分，如肉汤培养基、营养琼脂培养基等。在肉汤培养基中加入0.1%～0.5%的琼脂粉，则为半固体培养基；加入2%～3%的琼脂粉，即成固体培养基。固体培养基融化后分装在试管中可制成斜面，叫作琼脂斜面；分装在平皿内则制成平板，叫作琼脂平板。

2．营养培养基

在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清或酵母浸膏等营养物质制成的培养基，如血平板、血清肉汤等，可供营养要求较高的细菌生长。

3．鉴定培养基

用于鉴定细菌之用。即利用各种细菌分解糖、蛋白质的能力及其代谢产物不同，在培养基中加入某种特殊营养物质或指示剂，以便于观察细菌生长或发生的变化，如糖发酵管、醋酸铅培养基等。

4．选择培养基

不同种类细菌对各种化学物质的敏感性不同，如在培养基中加入胆酸盐可抑制革兰氏阳性菌的生长，而有利于革兰氏阴性的肠道致病菌生长。

5．厌氧培养基

专性厌氧菌在有氧条件下不能生长。利用物理或化学方法除去培养环境中的氧，以保证厌氧状态，或降低培养基中的氧化还原电势。一般方法是在液体培养基的表面加盖液体石蜡或凡士林，或在培养基中加入碎肉块可制成供厌氧菌生长的培养基。

此外，干燥培养基使用时按一定比例加入适量的水分即可，具有节省制备时间、携带方便等优点。

三、培养基制备要求

培养基为细菌的生长繁殖提供较好的条件和较适宜的环境，培养基质量好坏将直接影响微生物的生长情况。培养基制备要求如下：

（1）培养基制备时所用成分应根据配方按量称取，溶于蒸馏水。培养基制备前应对相应的试剂药品进行质量检验。

（2）测定调节pH值：培养基pH值要符合细菌生长所需，pH值应为7.2～7.6，否则会影响微生物的生长，从而影响结果的观察。pH值在热或冷的情况下其值有差异，pH值测定要在培养基冷至室温时进行。高压灭菌可使培养基的pH值降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多。指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完pH值后再加入。

（3）培养基应澄清透明，便于细菌生长情况的观察。培养基加热煮沸后，用脱脂棉或纱布过滤，以除去沉淀物。

（4）培养基中不应含有抑菌物质，盛装培养基不宜用铁、铜等容器，最好使用洗净的中性硬质玻璃容器。

（5）制备好的培养基既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般在121 ℃灭菌15 min即可。含有糖类、血清、明胶等的培养基应采用低温灭菌或间歇灭菌法。含有一些不可加热的试剂如卵黄、TTC、抗生素等，应待基础琼脂高压灭菌后凉至50 ℃左右再加入。

（6）培养基制备好后，应做无菌生长试验和所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养后，生化结果应呈正常反应。培养基不应储存过久，必要时可置于4 ℃冰箱存放。

（7）做好记录，每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果，制作人员应做好记录，以备查询。

四、培养基制备程序

1．配料

制备培养基的各种成分应按配方中的量精确称取。在称取时为防止错乱可将所需药品一次取齐，置于右侧，每种称取完毕，即移放于左侧。同时，每称完一种成分应在配方上做出记号，称取完毕后，再进行一次检查。

2．溶化

将称好的物质放入大烧杯或大烧瓶中蒸煮溶化。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，因蒸发而丢失的水分最后应补足。应注意在溶化过程中不可将营养物质放入铜锅或铁锅蒸煮，以防微量铜或铁混入培养基而抑制细菌的生长。同时，可用玻璃棒进行搅拌以加快溶化速度。

3．测定、矫正pH值

pH值的测定与矫正应在各成分完全溶解并凉至室温后进行，温度过高或过低溶液的pH值都会有所变动。pH值一定要准确，否则会影响细菌的生长。用pH试纸或pH计测定培养基的pH值，pH值应为7.2～7.6。若pH值低于7.2，则用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调至所需pH值；若pH值高于7.6，则用0.1 mol/L盐酸溶液调至所需pH值。

4．过滤

为保证制备的培养基澄清透明，可采用过滤或其他澄清法。一般液体培养基采用滤纸过滤法，琼脂培养基采用清洁的纱布趁热过滤。制备肉、肝、血和土豆等浸液时，用绒布将碎渣滤去，再用滤纸过滤。

5．分装

制备好的营养基质按使用的目的和要求，分装于试管、平皿、烧瓶等容器。分装量不得超过容器装盛量的2/3，能以形成2/3底层和1/3斜面的量为标准。培养基的分装装置和平板培养基的制备如图3-7和图3-8所示。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器，保证培养基分装均匀。为测定其最终pH值需留一部分分装于另一容器，并与已装好的培养基同时灭菌。

　图3-7　培养基的分装装置

图3-8　平板培养基的制备

6．灭菌

培养基的灭菌可采用121℃高压蒸汽灭菌法，灭菌15 min即可。某些含有不耐热的血清、糖类的培养基的灭菌要采用温度较低、压力较小的灭菌方法，温度不应超过100 ℃，时间为10～15 min；或者可在培养基灭菌后温度降至50 ℃左右，无菌条件下再加入不耐热的血液、血清、糖类等物质。

琼脂斜面培养基在灭菌后取出，并摆置成适当斜面，待其自然凝固即可，斜面培养基的制备如图3-9所示。

图3-9　斜面培养基的制备

（杜鹏：《乳品微生物学试验技术》，2008年）

7．无菌检验

对于备用、灭菌完全的培养基，应仔细检查一遍，并测定其最终pH值。在检查过程中如发现包扎纸破裂、培养基内水分浸入、营养基质色泽异常、管口棉塞脱落等现象，均应挑出弃去。

将灭菌检查合格的培养基放入37 ℃恒温箱培养过夜，如发现有细菌生长，则应弃去。再用有关的标准菌株接种1～2管培养基，置于37 ℃恒温培养箱培养24～48 h，如无菌生长或生长不好，则应追查原因并重复接种一次；如结果仍同前，则该批培养基应弃去，不能使用。

8．培养基的保存

培养基保存时间不宜超过一周，倾注平板培养基不宜超过3 d。保存时应存放于冷暗处，最好放于普通冰箱内。

技 能 单

一、原理

培养基是微生物生长所需的营养场所。培养基必须含有微生物生长所必需的基本营养成分，还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。

琼脂是应用最广的凝固剂，加琼脂制成的培养基在98 ℃～100 ℃下熔化，于45 ℃以下凝固。多次反复溶化，其凝固性降低。

二、材料与设备

蛋白胨、琼脂、牛肉膏、蒸馏水、氯化钠、乳糖、磷酸氢二钾、2%伊红溶液、0.65%美蓝溶液、0.04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、天平、灭菌烧杯、灭菌平皿、灭菌试管、灭菌吸管、乳钵等。(www.daowen.com)

三、流程

制备记录→选择所要制备培养基及其配方→培养基成分的称取→培养基各成分的混合和溶化→培养基pH值的初步调整→培养基的过滤澄清和分装→培养基的灭菌→培养基的质量测试。

四、方法与步骤

（一）营养琼脂的制备

1．配方

2．制法

将除琼脂以外的各种成分溶解于蒸馏水，加入15%氢氧化钠溶液约2 mL，校正pH值至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121 ℃高压灭菌15 min。

此培养基可供一般细菌培养之用，可倾注平板或制成斜面。如用于细菌计数，琼脂量为1.5%；如做成平板或斜面，则应为2%。

（二）伊红美蓝（EMB）琼脂的制备

1．配方

2．制法

将蛋白胨、磷酸氢二钾和琼脂溶解于蒸馏水，校正pH值至7.2～7.4。分装烧瓶，121 ℃高压灭菌15 min。临用时加入乳糖并加热琼脂，冷至50 ℃～55 ℃，加入伊红溶液和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

（三）乳糖胆盐发酵管的制备

1．配方

2．制法

将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于蒸馏水，校正pH值至7.4，加入指示剂，分装每管10 mL，并放入一个小倒管115 ℃高压灭菌15 min。

双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。

（四）糖发酵管的制备

1．配方

2．制法

将蛋白胨及相应的糖（乳糖、葡萄糖、蔗糖等）溶于蒸馏水，校正pH值至7.4，加入指示剂，按检验要求分装30 mL、10 mL或3 mL，并放入一个小倒管，115 ℃高压灭菌15 min。

双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。

（五）HE琼脂的制备

1．配方

2．制法

将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、蔗糖、水杨素、胆盐、氯化钠溶解于400 mL蒸馏水作为基础液，将琼脂加入 600 mL 蒸馏水。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内，调节pH值为7.5±0.2。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至50 ℃～55 ℃倾注平皿。

（六）牛肉膏蛋白胨培养基的制备

1．配方

2．制法

将蛋白胨、牛肉膏、NaCl及琼脂溶于蒸馏水内，校正pH值至7.4，并放入一个小倒管115 ℃高压灭菌15 min，分装每平皿10～15　mL。

五、实训报告

根据试验写出实训报告和试验体会，并分析试验过程中存在的问题和解决办法。

作 业 单

一、判断

1．制备培养基时pH值的测定要在营养物溶化后立即进行。　　　（　　）

2．高压灭菌时，如培养需含有一些不可加热的试剂如卵黄、TTC、抗生素等，应待基础琼脂高压灭菌后凉至50 ℃左右再加入。　　　（　　）

3．分装量不得少于容器装盛量的2/3，能以形成2/3底层和1/3斜面的量为标准。　（　　）

4.糖发酵管、醋酸铅培养基等属于鉴别培养基。　　　（　　）

二、简答

1．如何初步调整培养基pH值？

2．如何进行培养基的质量测试？

评 估 单

【评估内容】

一、名词解释

1．营养培养基　2．鉴定培养基　3．选择培养基

二、填空

1．培养基按其物理性状，可分为（　　）、（　　）及液体培养基；按其组成成分，可分为　（　　）、（　　）及合成培养基；按其作用，可分为（　　）、（　　）、选择培养基、　（　　）及（　　）等。

2．根据不同标本及培养目的不同，可采用不同方法进行培养，常用的有（　　）、　（　　）法及厌氧培养法。

3．营养培养基有（　　）、（　　）等。

4．基础培养基有（　　）、（　　）等。

5．在肉汤培养基中加入（　　）的琼脂粉，则为半固体培养基；若加入（　　）琼脂粉，即成固体培养基。

三、简答

1．细菌培养应具备什么条件？

2．简述培养基制备要求。

四、操作

制备细菌生长所需的普通琼脂培养基。

【评估方法】

以小组为单位进行评估。主要是在试验过程中进行，检查各小组是否掌握培养基的制备程序和方法，同时对各小组人员随机抽取2人进行提问。提问分数以2人平均分数计。

优：小组能独立并正确完成各项工作，正确回答问题。

良：小组能独立并正确完成大部分工作，个别环节仍需提示才能完成。及格：小组能基本完成大部分工作，其他环节有错误。

不及格：小组不能独立完成各项工作。

备注：项目十六任务四学习情境占模块三总分的6%。