【基本概念】

高压蒸汽灭菌器

【重点内容】

高压蒸汽灭菌器、生化培养箱、普通光学显微镜的使用方法及保养技术。

【教学目标】

1．知识目标

熟悉微生物实验室常用的仪器构造及其使用方法；知道各仪器的使用对象。

2．技能目标

熟练掌握高压蒸汽灭菌器、生化培养箱、不锈钢电热蒸馏水器、超净工作台、普通光学显微镜的使用及保养技术。

资 料 单

一、普通光学显微镜

普通光学显微镜是微生物检验工作中常用的贵重精密仪器之一，因此对它的使用和保护必须十分熟悉。

1．光学部分

（1）目镜。装在镜筒上端，刻有放大倍数，常用的有5×（放大倍数）、10×及15×。为了指示物像，镜中可自装黑色细丝一条，作为指针。

（2）物镜。位于镜筒下端，为显微镜最主要的光学装置。一般装有三个接物镜，分别为低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×）。各接物镜的放大率也可由外形辨认，接物镜放大倍数越大，镜头长度越长，反之，镜头长度越短；另外油镜上一般均刻有白线圈作为标志或者有oil字样。

（3）集光器。位于载物台下方可上、下移动，起到调节和集中光线的作用。

（4）反光镜。装在显微镜下方，有平、凹两面，通过自由转动可将最佳光线反射至集光器。不过现用的插电显微镜，通电后可直接调节光亮度。

2．机械部分

（1）镜筒。为一金属圆筒，位于显微镜前方，光线可从中通过。

（2）镜臂。在镜筒后面，为显微镜的握持部。

（3）镜座。用以支持全镜，是显微镜的底部。

（4）回转盘。位于镜筒下端，上有3～4个圆孔，接物镜装在其上。转动回转盘用以调换各接物镜。

（5）调节螺旋。分粗、细两种，在镜筒后方两侧。粗螺旋用于镜筒较大距离的升降；细螺旋位于粗螺旋的外侧，用以调节镜筒做极小距离的升降。

（6）载物台。位于镜筒下方，呈方形，用以放置被检物体。中央有孔，可以透光。载物台上装有弹簧夹可固定被检标本。弹簧夹连接推进器；捻动其上螺旋，能使标本前、后、左、右移动。

（7）光圈。在集光器下方，可以完成各种程度的开闭，借以调节射入集光器的光量多少。

（8）次台。位于载物台下方，可上、下移动，其上安装集光器的光圈。显微镜的结构如图3-5所示。

二、培养箱

培养箱也称恒温箱，是用于微生物培养的主要仪器。

图3-5　显微镜的结构

培养箱为方形或长方形箱体，分内、外两层。以薄钢板喷漆制成外层，壁上装有温度调节器可以调节温度。以铝板作为内层，夹层充以石棉或玻璃棉等绝缘材料以防热量扩散。内层底下安装电阻丝用以加热。箱门有双重，外为金属板门，内为玻璃门，安装玻璃门是为了便于察看箱内标本。箱内设有金属架数层。箱顶装有温度计一支，可以插入箱内，以便测知箱内温度。根据使用需要，实验室可常设37 ℃、30 ℃、22 ℃恒温箱各一个。恒温培养箱的结构如　图3-6所示。

图3-6　恒温培养箱的结构

三、冰箱

冰箱是实验室常用仪器之一，可分为普通冰箱与低温冰箱两种。前者温度为4 ℃～8 ℃，后者温度可保持低温至-20 ℃以下。冰箱主要利用箱内一定的低温保存培养基、血清、血液、生物制品、菌种、送验标本和某些试剂、药品等。冰箱也是开展病毒等检验工作必须具备的仪器。

四、电动离心机

电动离心机的种类有很多，包括小型倾斜电动离心机、大型电动离心机、低温电动离心机、高速电动离心机等。前两种转速均在5 000 r/min以下，后两者转速可高达10 000 r/min以上。离心的主要目的是使浑浊的液体标本离心沉淀，从而分离出试验所需要的成分，如血液中血清的分离。

五、水浴箱

水浴箱为血清学试验常用仪器。其为金属制成的长方形箱体，箱内盛以温水，箱底装有电热丝并配有自动调节温度装置。为使箱内水分加热后形成的水蒸气上升所凝结之水沿斜面流下，水浴箱盖皆呈斜面。箱内水至少应两周更换一次，并注意洗刷清洁箱内的沉积物。

六、干热灭菌器

（一）构造

干热灭菌器也称烤箱，其构造与培养箱基本相同，不同之处在于烤箱底层下的电热量大，关闭箱门通电后，箱内的温度可升至200 ℃以上。烤箱主要用于玻璃器皿的烘干或灭菌。

（二）使用烤箱时的注意事项

（1）需要灭菌的玻璃器皿，必须洗净后再行灭菌。

（2）箱内需灭菌的器皿不宜放得过挤，且不得与内层底板直接接触。

（3）箱内温度在160 ℃，维持2 h即可达到灭菌目的。为了保证器皿外包裹的纸张、棉塞不被烤焦，箱内温度不宜超过170 ℃。

（4）灭菌完毕后不得立即开门取物，应先断开电源，待箱内温度自动下降至50 ℃以下再开门取物，否则玻璃器材可能因骤冷而爆裂。

（5）玻璃器皿要烘干时，箱内温度应在120 ℃持续30 min，同时要打开箱顶部气孔，以利于水蒸气散出。若装有鼓风设备，则可加速干燥。

七、高压蒸汽灭菌器

高压蒸汽灭菌器有手提式、直立式和横卧式多种，各种灭菌器的构造和灭菌原理基本相同。其由双层金属圆筒和金属厚盖组成，双层金属圆筒分为内筒和外筒，内筒放需要灭菌的物品，外筒坚厚，水加于两筒之间。两筒上方有金属厚盖，盖上装有螺旋、压力表、放气阀、安全阀等，螺旋借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢；压力表显示内部的温度与压力；放气阀用以调节器内蒸汽压力与温度；安全阀用于保障安全。

高压蒸汽灭菌器主要用于培养基、试管、生理盐水、废弃的培养物及耐高热物品，如药品、纱布、敷料、手术器械、隔离衣等的灭菌，是应用最广、效果最好的灭菌器具。

技 能 单

一、材料与设备

高压蒸汽灭菌器、生化培养箱、干燥箱、显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸等。

二、流程

高压蒸汽灭菌器→生化培养箱→不锈钢电热蒸馏水器→超净工作台→普通显微镜。

三、方法与步骤

（一）高压蒸汽灭菌器

1．操作步骤

（1）加水。每次灭菌前都要加水，水位以刚刚浸到灭菌器内的底板支架为准。

（2）放物品。将需要灭菌的物品包扎好后，放入灭菌器内筛板上，但要注意物品不宜放得过挤。

（3）加盖。灭菌器加盖，上紧螺旋，使盖与桶体密合，但螺旋不宜旋得太紧，以免损坏橡胶密封垫圈。应注意加盖时螺旋要对称拧紧。

（4）加热排放冷空气。开通电源，电源指示灯亮起，电热管开始工作。刚开始加热时应将放气阀打开，以排放灭菌器内的冷空气，待有较急的蒸汽喷出时，冷空气排放完全，此时可关闭放气阀，锅内的压力开始上升。

（5）灭菌。当灭菌器内蒸汽压力（温度）升至所需灭菌压力（温度）值时，开始计时并维持20～30 min。在灭菌期间将压力（温度）稳定在灭菌压力（温度）值，待灭菌时间到达后，关闭电源，但此时不能马上打开锅盖，待锅内压力自然冷却至零或降至5磅（0.034 3 MPa）时打开放气阀，缓慢放气至压力为零时方可打开盖子取出物品。

（6）结束，打开盖子小心取出物品，擦拭干净后放回原处，灭菌完毕。

2．维护与保养

（1）灭菌前一定注意检查水位，金属锅盖要对称拧紧。

（2）注意灭菌前冷空气要完全排净。

（3）为节省时间，可提前20～30 min预热灭菌锅。

（4）等压力降至零时再打开盖子，取物品时注意不要被蒸汽烫伤（可戴上线手套）。

（5）灭菌锅要定期排污。

（二）生化培养箱

1．使用说明

（1）培养架上放置需要培养的物品。物品之间应保持适当间隔，利于空气的对流循环。（2）开通外电源，打开培养箱电源开关，电源指示灯、测量值、设定值都显亮。

（3）设定培养温度。设定培养温度时应按厂家使用说明书进行。

（4）工作完毕后，切断电源即可。(www.daowen.com)

2．维护与保养

（1）培养箱应放置在清洁整齐、干燥通风的工作间内。使用前，各控制开关均应处于非工作状态。

（2）易挥发性化学溶剂、低浓度爆炸气体、低着火点气体的物品及有毒物品不宜放入培养箱。

（3）按操作规程和操作要求使用培养箱，可延长培养箱的寿命。

（4）除试验需要外，应保持箱内温度稳定，避免频繁开启箱门，并防止灰尘、污物进入。低温使用时，为防止污染，应尽量避免在工作腔壁上凝结水珠。

3．恒温培养箱使用与维护

（1）箱内不应放入过热或过冷之物，取放物品时，应随手关闭箱门，以维持恒温。

（2）箱内可放入装水容器，以维持箱内湿度和减少培养物中的水分蒸发。

（3）培养箱各层金属架上不应放置过重物品，以免金属架被压弯而滑脱，防止物品损坏。最底层温度较高，培养物不宜与之直接接触。

（4）定期用3%甲酚皂溶液涂布消毒，后用清水抹布擦净。

（5）培养箱供细菌培养等用，不准作烘干衣帽等其他用途。

（三）电热蒸馏水器

1．操作步骤

（1）打开自来水龙头注水，直到水位达到蒸馏水器上玻璃小孔的位置。

（2）打开电源开关，仪器进入加热状态。

（3）等仪器内的水快要沸腾时，再次打开自来水龙头，开始蒸馏。

2．注意事项

（1）蒸馏水器开启后，要有专人负责，并要经常观察蒸馏水器内水位和自来水是否断流。避免因自来水水流太小或停水引起干烧。

（2）仪器长时间不用时应把蒸馏水器内的水放掉，并要定期清洗蒸馏水器内腔的水垢，这样可延长机器的使用寿命。

（四）超净工作台

1．操作步骤

（1）打开紫外灯杀菌半小时。

（2）关闭紫外灯，打开照明灯和鼓风机。

（3）用75%酒精擦拭双手。点燃酒精灯，开始试验操作。

（4）试验完毕后关闭照明灯和鼓风机电源，清理超净工作台，将废物缸中的垃圾弃去。

2．注意事项

（1）超净工作台的透明罩为有机玻璃，不得用酒精或其他有机溶剂进行擦拭。

（2）使用超净工作台时要先关紫外灯。如使用普通紫外灯，会产生大量臭氧，使用时应注意。

（3）超净工作台内切勿放置与试验无关的物品。

（五）显微镜

1．操作步骤

（1）显微镜的放置。将显微镜置于平整的试验台上，镜座距试验台边缘约10 cm。镜检时姿势要端正。

（2）光源调节。打开电源开关，调节安装在镜座内的光源灯的照明亮度。若使用反光镜采集光源，则应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜，并自由转动反光镜调节视野内的光线亮度，使其均匀、适宜。

（3）目镜调节。根据使用者的个人情况，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节。一般左目镜上还配有屈光度调节环，可适应两眼视力有差异的不同观察者。

（4）集光器数值孔径的调节。正确使用聚光镜才能提高镜检的效果。聚光镜的主要参数是数值孔径，它有一定的可变范围，一般聚光镜边框上的数字是代表它的最大数值孔径。为适应不同物镜的需要，可调节聚光镜下面可变光栅的开放程度，以得到各种不同的数值孔径。

（5）镜检。在目镜倍数保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜会得到不同的分辨率及放大率。作为初学者，在使用显微镜观察标本时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为在低倍镜下，所观察的物像的视野相对较大，易发现目标及确定检查的位置。

①低倍镜观察。将染色标本玻片置于载物台上并用标本夹夹住，移动推进器使所要观察的对象处于物镜的正下方。转用10倍的物镜进行观察，先用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节使物像清晰。通过移动推进器慢慢移动玻片，并找到合适的视野，仔细观察。

②高倍镜观察。将低倍镜下找到的观察目标移至视野中心后，再转用高倍镜并调节微调节器使物像清晰。通过移动推进器慢慢移动玻片，并找到合适的视野，仔细观察。在转用高倍镜进行观察时，可对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节。

③油镜观察。将高倍镜下找到的观察目标移至视野中心后，用粗调节器将镜筒升高，在待观察的视野区域加滴香柏油。然后转用油镜进行观察，首先从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜镜头浸在油中，并几乎与标本接触时止，但用粗调节器下降镜筒时用力不可过大，否则不仅会因为油镜镜头压到标本而压碎玻片，还会损坏镜头。然后调节照明使视野的亮度合适，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰为止。

（6）显微镜使用后的处理。显微镜使用后，上升镜筒，取下载玻片并用擦镜纸将标本片上的油吸干净。再用擦镜纸擦去镜头上的油，之后蘸取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，然后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。镜头上的油擦拭干净后将显微镜的各部分还原，即物镜转成“八”字形，再向下旋，反光镜垂直于镜座，同时降下聚光镜以免接物镜与聚光镜发生碰撞。最后用绸布清洁显微镜的金属部件并套上镜套，放回原处。

2．维护与保养

（1）透镜的清洁。用柔软纱布清除灰尘，若有不易除去的污迹如油脂，可以用干净的软棉布、镜头纸蘸上无水乙醇与乙醚的混合液轻轻地擦去。纯酒精和二甲苯均易燃烧，在将电源开关打开时要特别当心着火，并要切记不得用二甲苯清洗双目镜筒底部的入射透镜和目镜筒内的棱镜表面。

（2）油漆或塑料表面的清洁。仪器的油漆或塑料表面避免用任何有机溶液（如酒精、乙醇、乙醚、稀释液等）清洗。塑料表面只能用软布蘸上清水清洁。

（3）收纳。显微镜使用完或不用时，用防尘罩盖好并贮放在干燥的地方以免生霉，之后将物镜和目镜保存在干燥的容器中，并放干燥剂。

四、实训报告

分别绘出在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的细菌及霉菌的形态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。

作 业 单

1．用油镜观察时应注意哪些问题?在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用?

2．试比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作?

3．根据试验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。

4．微生物实验室中的冰箱和电动离心机有什么用途?

评 估 单

【评估内容】

一、判断

1．显微镜的回转盘用以调节镜筒作极小距离的升降。　　　（　　）

2．利用干燥箱灭菌时，灭菌完毕后可马上开门取物。　　　（　　）

3．高压蒸汽灭菌器灭菌完毕后应等到锅内的压力降至零时方可打开取物品。　　（　　）

二、填空

1．箱内温度在160 ℃，维持（　　）h即可达到灭菌目的。

2．高压蒸汽灭菌器有（　　）、（　　）和（　　）多种。

三、简答

1．如何识别油镜？

2．简述高压蒸汽灭菌器的使用方法及注意事项。

3．简述显微镜的使用方法。

【评估方法】

以小组为单位进行评估。对各小组人员随机抽取2人进行提问。提问分数以2人平均分数计，占此任务分值的80%，个人实习报告、作业等分值占此任务分值的20%。

优：能正确回答每个问题。

良：能正确回答大部分问题，稍微提示即可完成。

及格：能基本回答每个问题，但有个别错误。

不及格：回答不正确或者不能回答。

备注：项目十六任务三学习情境占模块三总分的10%。