【基本概念】

灭菌、消毒、防腐、巴氏消毒法

【重点内容】

实验室各类器械、器皿和培养基等常用的灭菌方法。

【教学目标】

1．知识目标

熟悉常用玻璃器皿的名称及规格；掌握实验室常用的灭菌方法。

2．技能目标

掌握微生物检验用玻璃器皿的正确消毒、洗涤和包扎技术。

资 料 单

一、消毒与灭菌

（一）基本概念

1．灭菌

杀灭物品中所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）的繁殖体和芽孢的方法叫作灭菌。

2．消毒

杀死物品中病原微生物的方法叫作消毒。消毒与灭菌的区别是：消毒只是杀死病原微生物，但不包括非病原微生物。具有消毒作用的药物称消毒剂。一般消毒剂在常用浓度下只对细菌的繁殖体有效，而对细菌芽孢无效。

3．防腐

防止或抑制微生物生长繁殖的方法叫作防腐。用于防腐的药物称防腐剂。某些药物在低浓度时起防腐作用，但在高浓度时就可能有消毒作用。

（二）灭菌方法

灭菌方法通常可分为物理灭菌法和化学灭菌法。

1．物理灭菌法

物理灭菌法主要有光、热及机械灭菌等方法，可根据不同需要选择采用。一般供细菌学检验用的玻璃器皿及器械常借热力灭菌。对于遇热易破坏的液体培养基，可用机械过滤除去细菌。热力灭菌法主要包括干热灭菌法和湿热灭菌法。

（1）干热灭菌法。常用的干热灭菌法有火焚法、火焰灭菌法及干燥灭菌法。

①火焚法。火焚法适用于被污染的纸张，试验动物脏器、尸体等无经济价值物品的灭菌。

②火焰灭菌法。火焰灭菌法是将耐燃烧物品直接在火焰上灼烧数次进行灭菌的方法，主要适用于接种环、金属器械等的灭菌。

③干燥灭菌法。干燥灭菌法是利用干热空气进行灭菌的方法，需在烤箱中进行，一般加热至100 ℃～170 ℃，经2～3 h即可达到灭菌目的。本方法适用于各种玻璃器皿、瓷器、金属制品及某些粉剂等的灭菌。

（2）湿热灭菌法。常用的湿热灭菌法有煮沸消毒法、高压蒸汽灭菌法、巴氏消毒法、流通蒸汽消毒法及间歇灭菌法。

①煮沸消毒法。煮沸消毒法是用煮沸消毒器或铝锅等煮沸20 min进行消毒。细菌的繁殖体煮沸15 min即可被杀死，芽孢则需煮沸1～2 h。如在水中加入2%～5%石炭酸，5～　10 min可杀死芽孢，如加入1%碳酸氢钠，可提高其沸点并促进杀死芽孢，同时可以防止金属器材生锈。本方法适用于医用器械（如剪、镊子、手术刀、胶管和注射器等）的消毒。

②高压蒸汽灭菌法。高压蒸汽灭菌法在15磅蒸汽压（0.102 9 MPa，温度可达121 ℃）下持续20～30 min即可杀死所有的微生物及其芽孢。高压蒸汽灭菌法是应用广、效果好的灭菌方法。此方法适用于耐高温又不怕水蒸气的物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、耐热药品、金属器材、玻璃制品和敷料等。

③巴氏消毒法。巴氏消毒法是将液体食品在较低的温度下消毒，这样既可杀死液体中的致病菌及其繁殖体，又不破坏液体物质中原有的营养成分。牛奶或酒类物质常采用此方法灭菌。具体方法有三种：第一种方法是以61.1 ℃～62.8 ℃，消毒30 min；第二种方法是以71.7 ℃，消毒15～30 s；第三种方法是以132 ℃，消毒1～2 s。现多用第二种方法。

④流通蒸汽消毒法。流通蒸汽消毒法是将要灭菌的物品放入阿诺氏灭菌器或普通蒸笼，通过蒸汽的流通进行灭菌，其温度接近100 ℃。细菌的繁殖体用此方法经15～30 min可杀灭，但芽孢不被杀死。

⑤间歇灭菌法。间歇灭菌法是用阿诺氏灭菌器或用蒸笼加热约100℃维持30 min，连续3 d每日进行一次，为的是将细菌的繁殖体杀死，而留有未能杀死的芽孢。将被灭菌物品取出放在室温或37 ℃恒温箱内过夜，可使未能杀死的芽孢生成繁殖体。然后连续3 d每日进行一次灭菌，可将芽孢生成的繁殖体全部杀灭。若为了杀菌更彻底，可继续用同样的方法再将灭菌物品在适宜的温度下放置一夜后连续3 d每日进行一次灭菌。必要时，加热温度可低于100 ℃，如用75 ℃，而延长每次加热的时间至30～60 min或增多加热次数，也可收到同样效果，例如含血清的培养基不能加热至100 ℃以上，为了消灭其中的细菌芽孢，可采用温度维持在75 ℃的间歇灭菌法。

（3）过滤。凡不能耐受温度或化学药物灭菌的药液、毒素、血清等，可使用滤菌器过滤的方法将细菌除去。

（4）紫外线。细菌检验室常用紫外灯来进行室内空气消毒。经照射30 min后，即可成为无菌区域，但在消毒照射时，工作人员应佩戴保护眼镜。需要注意的是：微生物的菌龄、分布密度、紫外灯照射时间及距离不同，紫外消毒对各种微生物的致死作用不同。

2．化学灭菌法

使用化学药物进行灭菌的方法叫作化学灭菌法。能抑制细菌繁殖的化学药物称为抑菌剂。能杀灭病原微生物的化学药物称为消毒剂。消毒剂对细菌和机体都有毒性，故只能用于体表或物品的消毒。理想的消毒剂应为杀菌力强、价格低、能长期保存、无腐蚀性、对机体毒性或刺激性较小的药物。有时同一化学药物，在低浓度时能抑菌，在高浓度时则可杀菌，甚至低浓度时反而会刺激细菌的生长。

二、常用玻璃器皿的种类及用途

微生物检验室所用玻璃器皿，应以能耐受高热、高压、所含游离碱较低的中性硬质玻璃制成，不致影响培养基等的酸碱度。

1．试管

要求管壁坚厚，管直而口平。常用试管有下列数种。

75（试管长）mm×10（管口直径）mm者，适于做康氏试验。

85 mm×15 mm者，较前者粗短，最适于做凝集试验。

100 mm×13 mm者，适于做生化试验、凝集试验及华氏血清试验等。120 mm×16 mm者，适于做斜面培养基等。

150 mm×16 mm者，较前者稍长，常适于做培养基。

200 mm×25 mm者，用以盛较多量琼脂培养基。

2．培养皿

常用培养皿的大小有50（指皿底直径）mm×10（指皿底高度）mm、75 mm×10 mm、 90 mm×10 mm、100 mm×10 mm等数种。

培养皿主要用于培养基的制备及细菌的分离培养。培养皿盖与底的大小应适合，不宜过紧或过松。培养皿盖除用玻璃制作外，一般不用不上釉的陶制皿盖，因为它能吸收培养基表面的水分，但较利于细菌标本的分离接种。

3．三角烧瓶

三角烧瓶容量有50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL、300 mL、500 mL、1 000 mL等多种规格，底大口小，便于加塞和放置平稳，多用于贮藏培养基和生理盐水等溶液。

4．刻度吸管

刻度吸管简称吸管，常用的吸管容量有1 mL、2 mL、5 mL、10 mL等多种规格，其壁上有精细刻度，用于准确吸取少量液体。做某些血清学试验也常用0.1 mL、0.2 mL、 0.25 mL、0.5 mL等容量吸管。

5．试剂瓶

试剂瓶有广口和小口之分，容量为30～1 000 mL。在应用时可以视所需剂量选用大小不同的试剂瓶。此外，试剂瓶还有棕色和无色之分，其中，棕色试剂瓶主要用于盛储避光试剂。

6．玻璃缸

玻璃缸内可常盛放石炭酸或甲酚皂溶液等消毒剂，主要用于消毒用过的载玻片、盖玻片、吸管等，还可以暂时盛放细菌染色后的染液。

7．玻璃棒

玻璃棒直径为3～5 mm，主要用于搅拌液体或做标本支架用。

8．玻璃珠

玻璃珠直径一般为3～4 mm或5～6 mm，常用中性硬质玻璃制成。玻璃珠主要用于血液脱纤维或打碎组织、样品和菌落等。

9．滴瓶

滴瓶容量有30 mL或60 mL，有橡皮帽瓶式、玻塞式等几种滴瓶，根据颜色又可分为棕色和无色两种，主要用于储存染色液。

10．玻璃漏斗

玻璃漏斗口径常用规格为60～150 mm不等，分为短颈和长颈两种，主要用于分装溶液或过滤液体。

11．载玻片、凹玻片及盖玻片

载玻片供作涂片等用；凹玻片供制作悬滴标本和血清学检验用；盖玻片为极薄的玻片，用于覆盖载玻片和凹玻片上的标本。

12．发酵管

常用的发酵管是将杜汉氏小玻璃管倒置于含糖液的培养基试管内，主要用于测定细菌对糖类的发酵情况。

13．注射器及大小针头

有1～20 mL注射器，注射针头有4、5、8和12号等多种规格，主要供做动物试验和其他检验工作用。

14．量筒、量杯

量筒、量杯为试验常用器具，大小不一，主要用于测量所需液体的量，但使用时不宜装入温度很高的液体，以防底座破裂。

技 能 单

一、原理

在微生物试验中，清洁无菌的玻璃器皿是保证得到正确试验结果的必要条件。因此，常用的玻璃器皿必须清洗干净，并要对需灭菌的培养皿、试管、三角瓶、吸管等加棉塞后进行包扎，用以保证玻璃器皿灭菌后的无菌状态。但是如果不会进行或不按操作规定进行这些看起来既简单又普通的操作工作，就会影响试验结果，甚至会导致试验的失败。因此在微生物实验室做好玻璃器皿的准备工作是保证试验结果的第一步。

二、材料与设备(www.daowen.com)

培养皿、吸管、试管、三角瓶、棉线、纱布、棉花、牛皮纸、报纸、高压蒸汽灭菌器、刷子、去污粉和相应的洗涤液。

三、流程

玻璃器皿的清洗→玻璃器材的晾干或烘干→器皿的包扎→灭菌。

四、方法与步骤

（一）玻璃器皿的清洗

1．新购的玻璃器皿的洗涤

将玻璃器皿置于2%盐酸溶液中浸泡数小时，以除去游离的碱性物质，然后用流水冲洗干净，倒置于洗涤架上晾干即可。

2．常用旧玻璃器皿的洗涤

常用三角瓶、培养皿、试管等可在洗衣粉溶液或肥皂水中煮沸20～30 min，待稍冷后，用毛刷洗去灰尘、油污、无机盐等物质，然后用自来水冲洗干净，洗刷干净的玻璃器皿烘干备用。如果玻璃器皿要盛高纯度的化学药品或者做较精确的试验，用自来水冲洗干净后，最后用蒸馏水洗2～3次。

3．载玻片及盖玻片的洗涤

用过的载玻片先放入含有5%石炭酸，或2%～3%甲酚皂溶液，或0.1%升汞等消毒溶液中浸泡24～48 h，再用洗衣粉溶液或肥皂水煮沸20～30 min，待稍冷后，逐个洗刷并用自来水冲洗干净，最后浸泡于95%的乙醇中备用。使用前，可用干净的纱布擦去酒精，并经火焰微热，使残余酒精挥发。

4．带菌玻璃器皿的洗涤

凡是带有细菌的各种玻璃器皿，必须经过高温灭菌或消毒后才能进行刷洗。

（1）带菌培养皿、试管、三角瓶等，做完试验后放入高压蒸汽灭菌器内121 ℃20～30 min后取出，并趁热倒出容器内的培养物，再用热的洗涤剂溶液洗刷干净。

（2）带菌的吸管、滴管、毛细吸管，使用后立即放入盛有3%～5%甲酚皂溶液或5%石炭酸等消毒液的玻璃缸内消毒24 h，然后取出用洗涤剂溶液煮沸20～30 min后清洗，最后用蒸馏水冲洗。

5．含油脂带菌器材的清洗

单独高压灭菌，先用高压蒸汽灭菌器灭菌121℃20～30 min，然后取出趁热倒去污物后倒放在铺有吸水纸的篮子里，并同篮子一同放入100 ℃烤箱内烘烤0.5 h，取出后用5%的碳酸氢钠水煮两次，再用肥皂水刷洗干净，最后用蒸馏水冲洗。

（二）玻璃器材的晾干或烘干

对于不急用的玻璃器材，一般可放在实验室中自然晾干。

对于急用的玻璃器材，可放入托盘或其他合适的器材内，如试管可放在试管架或试管框内，再放入烘箱内烘干，大件的器材可直接放入烘箱中烘干。

（三）器皿的包扎

为保证灭菌后的器皿仍保持无菌状态，需在灭菌前进行包扎。

1．培养皿

培养皿洗净烘干后每5～6支套叠在一起，用牢固的纸卷成一筒。

2．吸管

烘干的吸管在灭菌前可在口的一头塞入少许脱脂棉花，以防造成污染，之后可进行包扎。方法是每支吸管用一条4～5　cm的纸条，以30°～50°从吸管的尖端螺旋卷起，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，然后标上容量，吸管的包扎如图3-2所示。若吸管较多，可10支吸管包扎成一束进行灭菌。使用时，可从中间拧断纸条，抽出吸管即可。

3．试管和三角瓶

试管和三角瓶都要做棉塞，棉塞可将空气中的微生物过滤在器皿外面。棉塞要用棉花制作，松紧适宜，过紧不易塞入且易挤破管口，过松则易掉落和污染；长度以不小于管口直径的2倍为宜，棉塞的制作如图3-3所示；棉塞约2/3塞进管口。包扎时试管一般以10支包扎为一捆，在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸，再用绳扎紧，试管的包扎如图3-4所示。三角瓶加棉塞后单个在棉花部分用油纸包扎。

目前，国内已开始采用塑料试管塞，可根据所用试管的规格和试验要求来选择合适的塑料试管塞。

图3-2　吸管的包扎

（杜鹏：《乳品微生物学试验技术》，2008年）

（四）器皿的灭菌

包扎好的试管、培养皿、三角瓶等玻璃器皿，放入干燥灭菌器内160 ℃灭菌2 h或放入高压蒸汽灭菌器内121 ℃灭菌20～30 min。

　图3-3　棉塞的制作

（杜鹏：《乳品微生物学试验技术》，2008年）

图3-4　试管的包扎

五、实训报告

写出你所准备的玻璃器皿的清洗、包扎、灭菌过程及实习体会，并分析试验过程中的不成功之处。

作 业 单

一、填空

1．灭菌方法可分为物理灭菌法和（　　）。物理灭菌法又可分为（　　）、（　　）、过滤、紫外线灭菌法。

2．常用的湿热灭菌法有（　　）、煮沸消毒法、（　　）、（　　）及（　　）。

3．（　　）或（　　）常用巴氏消毒法。具体有三种：第一种方法是以（　　）℃，消毒30 min；第二种方法是以（　　）℃，消毒15～30　s；第三种方法是以（　　）℃，消毒1～2　s。

4．常用的干热灭菌法有（　　）、（　　）及（　　）。

5．高压蒸汽灭菌法是指温度达（　　）℃持续（　　）min杀菌。

二、简答

1．载玻片及盖玻片洗涤时溶液为什么一定要浸没玻片?

2．新购的玻璃器皿的洗涤与旧玻璃器皿洗涤有什么差异？

3．试管和三角瓶需要做合适棉塞的目的是什么？带菌玻璃器皿的洗涤应注意哪些问题？

4．使用过的载玻片及盖玻片应如何处理？

评 估 单

【评估内容】

一、名词解释

1．灭菌　2．消毒　3．防腐

二、判断

1．火焰灭菌法适用于医用器械如剪、镊子、手术刀、胶管、注射器等的消毒。　（　　）

2．干燥灭菌法适用于各种玻璃器皿、瓷器、金属制品及某些粉剂等的灭菌。　　（　　）

3．煮沸消毒法是用煮沸消毒器或铝锅等煮沸5 min进行消毒。煮沸消毒法适用于接种环、金属器械等的灭菌。（　　）

三、简答

1．常用的灭菌方法有哪些？

2．什么样的物品适用于高压蒸汽灭菌法灭菌？

3．新购入的玻璃器皿应如何洗涤？

4．带菌的培养皿或者试管等应如何处理？

四、操作

使用过玻璃器皿的正确洗涤、包扎、灭菌的操作情况。

【评估方法】

以小组为单位进行评估。主要在试验过程中进行，检查各小组是否掌握各种新旧玻璃器皿的处理和包扎的方法，同时对各小组人员随机抽取2人进行提问，提问分数以2人平均分数计。

优：小组能独立并正确完成各项工作，正确回答问题。

良：小组能独立并正确完成大部分工作，个别环节仍需提示才能完成。及格：小组能基本完成大部分工作，其他环节有错误。

不及格：小组不能独立完成各项工作。

备注：项目十六任务二学习情境占模块三总分的6%。