分子育种是将分子生物学技术应用于育种研究，具体而言，就是把供体植物带目的性状的遗传信息分离提取出来导入待改良的植物细胞，受精卵、种胚细胞等，培育出具有经济价值的新品种。

所谓分子育种主要包含两部分内容：一是分子标记辅助育种（也叫分子标记辅助选择），二是转基因育种（也叫基因工程）。

（一）分子标记辅助育种

分子标记辅助育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。可作为鉴别亲本亲缘关系，回交育种中数量性状和隐性性状的转移、杂种后代的选择、杂种优势的预测及品种纯度鉴定等各个育种环节的辅助手段。

1.油茶分子标记

广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。利用基因工程技术进行作物品种改良，系指以遗传工程技术，将特定基因或性状导入缺乏此基因或特性之目标作物的育种方法。因此，利用基因工程技术进行作物品种改良，可以突破种源之限制及种间杂交之瓶颈，创造新性状或新品种，亦即未来基因革命很可能迅速取代绿色革命。

随着现在生物技术的迅猛发展，传统意义上的油茶研究及应用手段，已经不能满足当今油茶产业快速发展的要求，迫切需要从分子水平上对油茶的遗传基础有个全面的认识。对油茶进行分子标记的目的是建立油茶不同品系的分子鉴别体系，并从中筛选与主要经济性状相关的特殊基因片段，有利于分子标记辅助选择育种。

目前常用的分子标记技术包括限制性片段长度多态性RFLP、随机扩增多态性RAPD、扩增片段长度多态性AFLP、简单序列重复（即微卫星DNA）SSR等。

（1）限制性片段长度多态性RFLP标记

限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）RFLP技术是第一代DNA分子标记技术。

原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分子中特定的位点，如果因碱基的突变、插入或缺失，或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生。那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，就可以得到长短、数量、种类不同的限制性DNA片段，通过电泳和Southern杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，选用一定的DNA标记探针与之杂交，放射自显影后就可得到反映个体特异性的DNA限制性片段多态性图谱。

（2）随机扩增多态性RAPD标记

随机扩增多态性RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）是建立在PCR基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的DNA分子标记技术。

原理：利用一个随机引物（一般为10个碱基）通过PCR反应非定点地扩增DNA片段，然后扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分离后配合溴化乙啶染色或银染等专一性染色技术即可记录RAPD指纹，进行DNA多态性分析。RAPD所用的一系列随机引物其序列各不相同，但对于每个特定的引物来讲，它同目标基因组的DNA序列都有其特定的结合位点、扩增DNA特定的区域片断，如果基因组的这些区域发生DNA片断或碱基的插入、缺失等突变，就可能导致这些特定结合位点、扩增片断发生相应的变化，而使RAPD扩增产物在电泳图谱中DNA带数增加、减少或片断长度发生相应变化，从而可以检测出基因组DNA在这些区域的多态性。

（3）扩增片段长度多态性AFLP标记(www.daowen.com)

扩增片段长度多态性AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）标记是一种检测DNA多态性的分子标记方法。

原理：基因组DNA经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，将特定的双链接头连接在这些DNA片段的两端，形成一个带接头的特异片段。通过接头序列和PCR引物3′末端的选择性碱基的识别，扩增那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将特异的限制性片段分离开来，然后利用成像系统和分析软件检测凝胶上DNA指纹的多态性。

（4）简单序列重复SSR标记，即微卫星DNA

微卫星是指以少数几个核苷酸（1～6个）为单位多次串联重复的DNA序列，亦称简单序列重复（SSR）。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，含量丰富，且呈随机均匀分布。微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性，这种多态性的信息量是比较丰富的。该技术即是基于基因组DNA重复序列的差异进行检测，不受组织、器官种类、环境条件等因素影响。

关于油茶分子标记的报道较多。中南林学院谭晓风教授等建立了改良CTAB法提取山茶属植物总DNA的技术方法，2003年，张智俊博士等在此基础上进行改良为同时提取DNA与RNA方法，改进了油茶RAPD反应体系，所得到的DNA和RNA纯度高，完整性好，为油茶的分子标记研究打下基础。福建林学院张云博士等也对油茶随机扩增多态DNA条件做了研究。张云等以改进的CTAB法提取油茶嫩叶总DNA，进行随机扩增多态NA（RAPD）分析，分别测试了Mg2＋浓度、引物浓度、d NTP浓度、模板DNA浓度和taqDNA聚合酶用量对反应结果的影响，确定了油茶RAPD分析的最适反应体系。黄永芳等优化了适用于油茶种质资源RAPD分析的DNA提取和PCR扩增条件；还探讨了引物数量、多态性比率和所用引物谱带丰富度对聚类分析结果的影响，结果表明，聚类分析准确度与引物数量、引物的谱带丰富度有关，多态性比率不是选用引物的主要标志。张智俊等以22个引物对12个油茶优良无性系进行RAPD标记，得到了141条多态性谱带，并通过引物将优良无性系与自然植株区别开来。雷治国等通过18条引物对90个油茶优良无性系进行RAPD标记，得到569条多态性谱带，其多态比率达到94.7%，还找到了32条特异性谱带。湖南省林业科学院陈永忠等也对油茶“雄性不育”优良无性系进行鉴别标记，为建立比较完备的油茶优良无性系鉴别体系积累了丰富的技术与资料。温强等进行了油茶的简单重复序列间扩增（ISSR）分析，建立了可适用于其他ISSR引物和其他油茶品种的ISSR-PCR优化体系，该反应体系稳定可靠，可用于油茶品种的分子鉴别和遗传关系分析。张国武等进行了油茶的ISSR分子标记研究，聚类结果表明，油茶优良无性系与普通油茶实生苗存在较大的遗传差异，同时也较准确地进行了各优良无性系的分子鉴别，为油茶的良种选育提供了理论依据。这些研究为今后开展油茶的分子标记辅助育种打下了良好的基础。

2.油茶分子图谱的构建与基因的分离

遗传图谱是指某物种各种遗传标记在染色体上的线性排列图。构建油茶遗传连锁图，一是需要合适的遗传作图群体；二是需要利用各种遗传标记。通过分析各种标记之间、标记与性状之间的连锁关系建立遗传连锁图。油茶遗传作图群体最好是F2群体，选择利用差异较大的群体单株进行杂交得到F1代，用F1代单株进行自交得到F2代，此时F2代群体为分离群体可作为作图的遗传群体。利用RFLP、SSR等共显性标记技术作图群体各单株的DNA进行遗传分析，依据各单株分子遗传标记出现的情况，通过遗传连锁软件的数据运算，建立相应的油茶遗传连锁图。油茶含有许多重要的优质基因，如油茶品质、抗逆性等。分离克隆这些基因，对于油茶的遗传改良具有重大价值。基因分离克隆的方法有许多，但就油茶来说主要有：其一，从EST文库中分离克隆，首先对EST数据进行生物信息分析，可以找到某些特异组织特异表达的重要基因，从而分离克隆其cDNA序列，利用其cDNA序列，还可从基因组中“钓取”其基因组序列，进而克隆其基因组序列；其二为图位克隆法，利用构建的遗传图谱、图位克隆，采用染色体步查分离克隆相关的基因；其三为差示cDNA减法杂交法（cDNA与mRNA杂交），基于油茶不同组织和发育阶段，或某个组织受到某种影响而呈现的特殊基因表达的差异，选择有差异的组织分别提取mRNA，其中一方经逆转录合成cDNA，另一方用生物素酰化标记，将两者进行分子杂交，从中筛选出不能杂交的部分，进而分离克隆特异表达基因。

油茶的相关遗传背景比较复杂，要分离克隆油茶的基因，最直接的方法是先建立cDNA文库，然后利用杂交或者其他方法来筛选和分离目的基因。2004年，胡芳名等首次报道了油茶种子cDNA文库的构建，以湘林1号和湘林4号油茶优良无性系近成熟的种子为材料，构建了油茶种子油脂转化高峰期的cDNA文库，为油茶种子中与油脂合成有关的关键酶基因和其他基因的分离克隆奠定了重要的基础，在所构建的cDNA文库中挑选了2 000多个克隆进行测序分析，从中分离出油茶种子中与脂肪酸、蜡合成和代谢有关的主要基因脱酰ACP硫酯酶基因（FatB1）、硬脂酰-ACP脱饱和酶基因（SAD）、油酸脱饱和酶基因（FAD2）、FAD8基因、ACP基因等。在此基础上，石明旺等总结探讨了油茶种子cDNA文库构建中的问题与对策；胡芳名等分析油茶种子中储藏相关基因表达情况，大量的油体蛋白和储藏蛋白基因获得了表达，表明种子已经发育到成熟阶段。谭晓风等研究了油茶种子中的贮藏蛋白基因、与基因表达调控相关的基因、抗逆相关基因、种子成熟和胚胎发育相关的基因等几类基因，结果显示，它们表达的数量和趋势与种子接近发育成熟阶段相吻合。张党权等采用生物信息学方法，从随机测序而构建的油茶优良无性系湘林1号种子EST文库中初步鉴定了与油茶脂肪酸形成相关的大部分关键酶基因，并对其中几个直接控制不饱和脂肪酸的形成与转化的基因进行了相应的序列分析。2008年，张党权等在以前构建的油茶cDNA文库和EST文库的基础上，通过5′RACE技术获得了油茶SAD基因的全长cDNA，通过较系统的生物信息学分析表明，油茶SAD基因在进化上较为保守，与其他植物SAD的相似性较高，为油茶SAD基因的开发应用及其他油脂植物的遗传改良奠定了理论和技术基础，也为油茶其他重要性状基因的全长cDNA克隆提供了借鉴。谭晓风等在构建的油茶EST文库基础上，采用5′RACE和交错延伸PCR技术，首次报道获得了油茶油脂合成代谢的关键酶基因FAD2基因的全长cDNA克隆，为油茶FAD2基因的结构和功能研究，以及转基因应用奠定了基础。谭晓风等以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础，采用分子生物学技术分离克隆了油茶酰基载体蛋白基因全长cDNA序列，分析比较的结果表明，油茶酰基载体蛋白与油橄榄ACP的相似性最高。以上这些基因已部分登陆到了GenBank，为油茶转基因育种与定向培育研究奠定了基础。

3.油茶功能基因表达检测

在油茶功能基因表达检测方面，国外基本上没有进行过分子生物学方面相关的研究。至目前，GenBank等数据库中未见与油茶相关的DNA、cDNA或mRNA的登录序列，也未见文献报道。油茶重要性状基因的分离鉴定更是处于研究的起始阶段。油茶育种的目标是提高产油量，为了从更深层次探索油茶油脂转化过程中其功能基因的作用情况，陈永忠等利用基因芯片技术对油茶果实的功能基因进行检测，旨在绘制各功能基因在油茶果实油脂转化过程中的表达图谱，为进一步深入开展高产油量、高含油量的油茶新品种的定向培育作前期探索研究。胡芳名等以油茶优良无性系“湘林1号”和“湘林4号”近成熟种子为材料构建cDNA文库，随机挑取2327个克隆进行3′端测序，并将所得序列与核酸数据库进行同源性比较，发现有88条油脂储藏蛋白相关基因和3种61条储藏蛋白基因表达，并具有典型的“时、空”特点。这些结果为揭示近成熟时期油茶种子中储藏蛋白特异表达的丰度和生理情况提供了科学依据。

（二）转基因育种

转基因育种就是将基因工程应用于育种工作中，通过基因导入，从而培育出一定要求的新品种的育种方法。利用基因工程技术可将外源基因直接导入油茶受体细胞或组织中，并经组织培养直接培育出转基因植株，实现对某单一性状进行有目的改良，缩短育种周期，避免常规育种中的连锁累赘。根据人类的需要，可以通过正常的转基因技术增加某种脂肪酸的含量，也可以通过反义技术减少某些脂肪酸的含量，从而实现对各脂肪酸比率的调控。另外还可以通过转基因技术来提高油茶的单位面积产量，提高适应性等。

油茶转基因植株培养建立在其组织培养成功的基础之上，油茶主要利用农杆菌法、基因枪法等进行转基因研究，然后主要通过简便、快速PCR或RFLP杂交的办法进行转基因植物的筛选。总体来说，油茶转基因育种技术尚未完全成熟，目标基因的确定、合适的载体与相应的转导技术等有待进一步研究，但时机一旦成熟，对油茶特定脂肪酸组成、高含油量、高抗病虫害新品种的转基因定向培育将是油茶转基因育种最有前景方向之一。油茶转基因育种尚处于研究阶段。

在常规育种的基础上，开展油茶生物技术育种，通过分子标记和遗传图谱的构建等基础工作，进一步深入开展分子标记辅助选择育种和目标基因的定位和克隆；结合油茶主要经济性状与其功能基因的表达机理，利用基因重组技术，通过筛选和研究油茶抗性基因及表达机理，培育转基因高产及抗虫、抗病新品种；通过研究油茶油脂形成过程中控制脂肪酸脱氢酶的基因及表达培育高油酸和高亚油酸新品种，提高油茶含油率和优化油脂质量；实现油茶生物技术定向培育高产、优质和高抗新品种，为油茶育种开辟了一个新的领域。