哥伦布在塞维利亚卧床不起，几乎不能动弹，他听说女王病得更厉害。

女王已经在临终前写下遗书：“我真切地请求我主国王，我委托和命令我的女儿公主和她的丈夫王子，不要允许和容忍那些生活在已发现和将要发现的群岛和大陆上的土著居民遭受任何人格和财产凌辱。相反，我希望他们受到很好的公正的对待。如果他们受到了什么凌辱，要给予补偿并防止再次发生。”

11月26日，远在麦迪纳·德尔·坎普市（Medina del Campo），伊莎贝拉一世女王病逝。

哥伦布给大儿子写信，让他设法打听一下，女王在遗嘱中是否留下关于他的什么话。很遗憾，女王的遗嘱完全没有提到哥伦布，相反上面摘录的那段遗嘱仿佛是针对哥伦布的过失而言，似乎是对他的批评。

女王不在了，哥伦布的财产问题和年金问题，只能向斐迪南二世力争。

他给大儿子写信，说正在申请北上，争取来年1月底出发。但国王批准他北上已是1505年2月。可能是害怕寒冷，哥伦布一直等到5月，才前往巴里亚多利德。

斐迪南二世热情地接见了哥伦布，建议他委托一个人，在枢密院继续办理海军上将职务内的事情。哥伦布说塞维利亚大主教德萨（Diego Deza）最合适，哥伦布能去中美洲群岛探险，德萨和他的侍从卡布雷拉（Cabrera）功不可没。国王表示同意，让德萨处理哥伦布的事情。

哥伦布认为，自己应该和国王平等，他要求一切关于他的特权问题都要用法律途径解决。德萨也决定，一切由律师来办，不必交给政府。但国王却认为一切物质利益问题可以交给法院裁决，但在中美洲群岛的政府行政问题上，任何臣民都不能去和自己在法院打官司。(www.daowen.com)

国王试探着，想用西班牙的一块伯爵封地换取哥伦布放弃特权，但哥伦布气愤地拒绝了。

失望和愤怒使哥伦布的病情恶化了，8月25日，他立下了遗嘱。

这份遗嘱并非像我们臆想和传说的那样，首先感谢他的天使投资人，因为没有女王，就没有他的一切，其次回顾自己的一生。实际上，哥伦布开宗明义，并且贯穿始终，谈的全是头衔和财产的世袭继承问题。直到此时，他仍未从中美洲群岛得到收益，所以他无法按照他的想法真正分配收入。他在遗嘱中非常注意保证情妇恩里克斯的权益。

神圣罗马帝国皇帝马克西米利安一世的儿子腓力一世（Felipe I），企图以双王次女胡安娜的丈夫的名义，继承西班牙王位。他把拥有合法继承权的妻子从冷宫里领出来，1506年1月8日离开他们的佛兰德统治区，动身前往西班牙。

没想到，腓力一世和胡安娜船沉英国，在那里停留了几个星期，4月28日才抵达西班牙西北的拉科鲁尼亚省（La Coru?a）。此时，哥伦布抱病写下最后一封信，及时向新君表示敬意，同时提出申诉和希望。但腓力一世把全部精力用在了和岳父斐迪南二世的明争暗斗上，翁婿争执险些酿成内战，根本无暇顾及哥伦布的诉求。而斐迪南二世宣布：胡安娜已经成为女婿的囚徒，所以应该是他本人，而不是他女婿，可以成为西班牙的共治君主。

5月19日，哥伦布宣读了他的遗嘱，两位公证人签上了各自的名字。

5月20日，主升天日，哥伦布穿着灰色长袍躺在床榻上，他的最后遗言是：“上帝，我将灵魂交到您手中。”