细胞外病毒可以繁殖吗？

病毒是专性寄生物，不能在细胞外独立增殖。但在实验室内，人们已经能够在无细胞条件下进行病毒和病毒成分的合成，不仅标志着人类对病毒增殖的本质有了充分的了解，而且可能进一步完全控制病毒体外合成的每一个细节。

（旁注）考考你

（旁注）病毒可以在细胞外独立增殖吗？

寡核苷酸合成和连接方法、聚合酶链反应（PCR）以及信使RNA体外翻译系统的建立，为病毒核酸和蛋白质的合成提供了十分有效的手段。

1.无细胞条件下的病毒蛋白合成

由于病毒核酸都是多顺反子的，所以在感染细胞内常由一个病毒DNA分子产生出许多个信使RNA。如是RNA病毒，病毒RNA也将编码出若干不同的蛋白质，因此，很难在体外合成某一种特殊的病毒蛋白。无细胞条件下的病毒蛋白合成，最先成功于RNA噬菌体。先用酚抽提法由噬菌体提取RNA（作为信使RNA），同时应用稀盐法和离心澄清法由大肠杆菌提取核糖体。然后将核糖体与病毒RNA混合，加入三磷酸腺苷（ATP）和三磷酸鸟苷（GTP）以及磷酸丙酮酸和丙酮酸激酶等，再加氨基酸，置于内含镁离子和氯化钾的三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液中，25℃～35℃温育30分钟，出现病毒蛋白。此后，即可应用三氯醋酸法将新合成的病毒蛋白沉淀出来，也可应用DEAE－纤维素或葡聚糖柱分离，进行鉴定。

也曾在体外由某些动物病毒，例如腺病毒、乳多空病毒、痘苗病毒以及副流感病毒、呼肠孤病毒和水疱性口炎病毒等的信使RNA或RNA，在有细胞抽提物的条件下翻译出病毒蛋白。

2.无细胞条件下的病毒核酸合成

腺病毒

最先合成成功的病毒核酸是噬菌体的RNA，也是先用酚抽提法由噬菌体提取RNA，作为模板。另从感染细胞提取复制酶，并用密度梯度离心沉淀法和色谱法加以提纯。将RNA和复制酶混合，置于内含镁离子的Tris缓冲液中，并加入几种三磷酸核苷，如ATP、GTP、CTP和UTP。30℃温育30～60分钟，即可产生新的噬菌体RNA。

由于动物病毒的RNA比噬菌体的RNA大得多，所以很难在抽提和温育过程中保证其模板完整性。但在流感病毒、呼肠孤病毒以及水疱性口炎病毒，已在体外发现其依赖RNA的RNA聚合酶的核酸合成活性。艾伦费尔德等曾在感染HeLa细胞内分离获得脊髓灰质炎病毒的RNA聚合酶，可以用于脊髓灰质炎病毒RNA的体外合成。在某些RNA动物病毒，病毒粒子上结合有病毒特异的RNA聚合酶，就可直接应用这样的病毒粒子在上述条件下体外进行病毒核酸合成。(www.daowen.com)

RNA聚合酶

3.无细胞条件下病毒粒子的合成

病毒信使RNA在最适离子浓度下与正常细胞浆内的某些成分发生反应之后，就可以形成新的感染性病毒粒子。小RNA病毒核酸具有信使RNA活性，最易在无细胞条件下合成病毒，这里即以小RNA病毒为例说明无细胞条件下的病毒合成。

RNA病毒（脊髓灰质炎病毒）复制模型

脊髓灰质炎病毒RNA（或人工合成的感染性cDNA）在依赖RNA的RNA聚合酶（或依赖DNA的RNA聚合酶）作用下，可以大量复制新的RNA分子。这种RNA分子与核糖体、tRNA等混合后，即能产生出病毒蛋白。病毒衣壳蛋白VP0、VP1和VP3都有独特的对称性构型。在自然条件下，通过疏水性基团的相互吸引，形成初聚体。许多初聚体又规律性地组合成2∶3∶5对称的衣壳。应用基因工程技术表达出来的病毒蛋白，常在体外自发形成空衣壳颗粒。病毒RNA分子究竟是在衣壳形成的同时进入，还是在衣壳形成之后再行入壳，有待于进一步阐明。

DNA病毒（腺病毒）复制模型

病毒粒子的形成过程伴随着病毒蛋白和病毒核酸构型的变化，在VP0自行裂解为VP2和VP4时，蛋白构型的变化最为明显，这一空间构型的变化是不可逆转的。病毒粒子此时变得坚固了，成为所谓的“成熟病毒”。

研究证明，病毒体外合成需要许多细胞成分和特定的条件。除必需的核糖体和tRNA等外，还需某些完整的胞膜以及一定的离子浓度乃至温度。

（旁注）考考你

（旁注）病毒在细胞外的增殖需要什么条件？