百科知识 5′核酶分析:利用TaqMan技术高通量分型的成果

5′核酶分析:利用TaqMan技术高通量分型的成果

时间:2024-01-08 百科知识 版权反馈
【摘要】:在5′核酶分析或Applied Biosystems公司TaqMan R技术中采用了均质液相反应,利用Taq聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性在PCR扩增过程中产生报告荧光信号来辨别等位基因型。图2-45′-核酶分析(Taqman ?由于对探针的荧光和猝灭特性进行修饰的需要较高成本,这种TaqMan技术更适合在大量样本中分析有限数量的SNP。目前,许多供应商可以应客户需求提供探针设计和检测验证,从而使得TaqMan技术成为日常工作中能够运用的高通量分型的手段。

5′核酶分析:利用TaqMan技术高通量分型的成果

在5′核酶分析(5′nuclease assay)或Applied Biosystems公司TaqMan R技术中采用了均质液相反应,利用Taq聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性在PCR扩增过程中产生报告荧光信号来辨别等位基因型。

在一个PCR体系中,除了扩增引物外,还包含一对位于扩增引物之间的TaqMan探针,探针序列设计为分别与野生型和变异型互补,每一种独特的探针优先结合一种等位基因,探针与非靶序列的结合被大大弱化甚至完全消除。在TaqMan探针的5'末端标记有报告荧光染料,如FAM等;在探针序列的3'末端标记有淬灭染料,如TAMRA等。由于探针序列很短,两个基团空间位置很近,构成荧光能量传递的关系,没有荧光信号产生。在PCR扩增时,引物模板退火,探针可与多态性模板杂交结合,在随后的延伸反应中,当引物延伸合成至探针与模板结合处,Taq聚合酶的5'-外切酶活性降解探针的5'-报告荧光基团,使之与淬灭基团分离,释放荧光信号。通过在探针中标记不同的报告荧光染料,使得等位基因型能够被准确判别(图2-4)。

图2-4 5′-核酶分析(Taqman ?R

另一种利用杂交技术进行SNP分型方法是采用波长飘移的分子灯塔探针,这是一种带有茎环结构的分子探针。在未结合到目标序列的游离状态下,茎环结构使荧光基团靠近淬灭基团,荧光信号无法产生。当探针与目标序列退火结合,茎环结构被打开,荧光基团与淬灭基团分离,荧光信号被释放。在扩增过程中荧光信号强度与被扩增的模板量成正比,且能够被实时或至少在PCR之后就被检测出来(图2-5)。(www.daowen.com)

由于对探针的荧光和猝灭特性进行修饰的需要较高成本,这种TaqMan技术更适合在大量样本中分析有限数量的SNP。TaqMan检测可以在96孔或384孔板中进行。由于探针掺入和荧光信号检测在PCR扩增过程中同步进行,避免了PCR扩增后的检测过程,因此TaqMan技术具有低错误率和用户界面友好的优点。此外,对仪器装备的投资比质谱相对要低。

图2-5 分子灯塔技术

TaqMan技术的精确性高度依赖于杂交条件,影响因素包括缓冲条件或引物浓度,因此探针设计和检测体系优化费时费力。目前,许多供应商可以应客户需求提供探针设计和检测验证,从而使得TaqMan技术成为日常工作中能够运用的高通量分型的手段。

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