黄曲霉毒素生物降解脱毒的研究进展

武汉东湖学院生命科学与化学学院　彭晓娅

黄曲霉毒素具有强毒性和强致癌性，这类毒素严重威胁动物的生产性能和人类健康，被世界卫生组织列为一类致癌物。利用物理和化学方法去除黄曲霉毒素具有种种应用缺陷，而生物降解黄曲霉毒素是目前比较高效、安全且环保的解毒方法。本文对国内外黄曲霉毒素生物降解的研究进行了综述。

黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等真菌产生的次生代谢产物。目前已发现的黄曲霉毒素有20余种，其中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2四种是最常见的，而AFB1的毒性最强。1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO） 的癌症研究机构划定为一类致癌物，毒性比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍，仅次于肉毒毒素。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。

黄曲霉毒素主要污染粮油食品、动植物食品等，如花生、小麦、玉米、豆类、坚果类、乳及乳制品、水产品、肉类等均有黄曲霉毒素污染。其中以花生和玉米的污染最为严重，尤其是在高温高湿地区粮油及制品中检出率更高。研究发现，通过食物链进入人体的黄曲霉毒素致癌作用极强，会严重威胁人类健康。因此，解决黄曲霉素对粮食和饲料的污染是一个世界性难题。

传统的黄曲霉毒素脱毒方法主要有物理和化学方法，包括有碱处理法（氢氧化钠法和氨化法）、氧化处理法（常用氧化剂有臭氧、过氧化氢和次氯酸钠等）、高温法（268℃以上）、抗氧化剂法、吸附剂（常采用硅铝酸盐等）等，但这些方法存在去毒不彻底、营养成分易流失、成本高和难以规模化生产等缺陷，因此实际脱毒效果并不理想。

Bata等（1999年）提出有效的霉菌毒素脱毒方法应满足以下几点：毒素被破坏或是被转化成无毒化合物；真菌孢子和菌丝体被破坏，这样不会产生新的毒素；饲料保持原有的风味和营养水平；原料的物理性状不被明显改变；去毒加工应经济可行。

黄曲霉毒素的生物脱毒方法主要是利用微生物或其产生的酶及其制剂来进行脱毒，该技术不仅处理条件相对温和，不会破坏产品的品质，而且有些还能增加产品的营养价值。因此，生物脱毒逐渐成为研究的热点之一。目前已发现自然界中有多种微生物能吸附或降解食品或饲料中的黄曲霉毒素，包括细菌、酵母菌、放线菌、霉菌和藻类等。研究表明，微生物对黄曲霉毒素的作用主要表现在两方面，一是微生物菌体本身及其细胞壁提取物对黄曲霉毒素的吸附作用，另一个是微生物代谢产生的酶或者是从植物中提取的酶对黄曲霉毒素的降解作用。由于利用微生物或其代谢产物进行解毒具有对饲料和环境无污染、不影响饲料的营养价值，以及能够避免毒素的重新产生等优点，代表了生物解毒的新方向，且生物酶催化方法具有专一性强、转化效率高等特点备受研究者的关注。

黄曲霉毒素生物降解，是指黄曲霉毒素分子的毒性基团被微生物产生的次级代谢产物或所分泌的胞内、胞外酶分解破坏，同时产生无毒的降解产物的过程。毒素生物降解不是对毒素的物理性吸附作用，而是一种化学反应的过程。依据解毒菌的种类，大致可分为真菌和细菌。

一、真菌生物降解黄曲霉毒素的研究

早在1968年，Detroy等报道，黄曲霉毒素B1环戊烷环上的酮羰基可被树状指孢酶（Dactylium dendroide）生化降解。Cole等（1972年）也报道了黄曲霉毒素B1被少根根霉（R.Arrhizus）生物降解为异构羟基化合物。Doyle等（1979年）发现寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）能够产生过氧化物酶降解黄曲霉毒素B1，并指出毒素被降解的量与过氧化物酶的量之间存在直接的关系。Huynh等（1984年）研究发现，寄生曲霉在生长14d以上时对黄曲霉毒素B1有很好的降解能力，但在生长4d左右时，年轻的菌丝体可能产生黄曲霉毒素B1。Shantha（1999年）研究发现，茎点霉（Phoma sp.）对黄曲霉毒素B1的降解率可达到99%，并认为是其细胞提取物中的一种热稳定酶发挥作用。Motomura等（2003年）对糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）进行研究，从其产物中分离纯化出分子量为90kDa的胞外酶，同时对该酶解毒反应的最佳温度（25℃）和pH（4—5）等反应条件进行了研究，通过荧光检测表明，此酶可以断裂黄曲霉毒素的内酯环。Zjalic等（2006年）对白腐菌（Trametes versicolor）进行研究，认为其可能成为生物控制黄曲霉毒素的又一微生物资源。

国内对黄曲霉毒素生物降解研究的较少。暨南大学刘大岭研究小组研究的最早，也开展了比较多的工作，取得了显著成果。他们研究发现，从真菌假密环菌（Armillariella tabescens）提取的粗酶液可使样品中的黄曲霉毒素B1含量减少80%，活性物质解毒作用的pH、时间及温度等特征表明，粗酶液中的一种胞内酶起解毒作用。之后，他们从该真菌的菌丝提取物中分离纯化出一种可去除黄曲霉毒素毒性的解毒酶，通过克隆得到其基因序列并成功转化到毕赤酵母表达系统中，并且还对该酶的固定化技术进行研究。

陈仪本等（1998年）研究发现，黑曲霉（Aspergillus niger）菌丝提取物可以降解花生油中的黄曲霉毒素，该活性物质解毒作用效率高，而且通过水分、时间、温度等对其解毒反应的试验表明，降解过程属于酶促反应。该研究小组考虑到酶促反应必须有水存在，所以选用谷壳培养法将解毒酶固定化，从而解决了在含水量低的环境下酶制剂难以作用的难题。

李冰等（2012年）研究得到降解黄曲霉素B1效果最佳的一种黑曲霉，其对黄曲霉毒素B1的降解率可达93.28%，起降解作用的主要是一种生物活性酶。通过小鼠的急性毒性试验和发霉饲料中霉菌毒素的降解来看，黑曲霉及其产生的活性物质对黄曲霉毒素B1生物降解效果温和，安全性高，且有操作简单、成本低等优点。

二、细菌生物降解黄曲霉毒素的研究

研究认为，细菌及其代谢产物生物降解黄曲霉素多源于胞外代谢产物。

1967年，Lillehoj等首先发现橙色黄杆菌（Flavobacterium aurantiacum）能够去除溶液中的黄曲霉毒素。

Line等（1995年）利用C标记黄曲霉毒素B1与橙色黄杆菌进行反应，并对放射性物质进行追踪和检测。研究表明，无论是活细胞还是死细胞均可以降低黄曲霉毒素B1的含量，但活细胞的作用远大于死细胞，且只有活细胞能释放被标记的CO₂，表明一定量的黄曲霉毒素B1被菌体细胞所代谢。这种方法也为研究黄曲霉毒素B1在动物体内的代谢途径提供了参考。另外，他们还发现在温度为35℃、pH为7、培养时间为72h时，能够最大限度从溶液中去除黄曲霉毒素且没有新的有毒物质产生，并且菌体浓度越高越好。

Smiley等（2000年）研究表明，橙色黄杆菌的粗蛋白提取物在水溶液中可降解黄曲霉毒素B1，降解率可达74.5%，但是将蛋白质热处理失活后却只能降解5.5%的黄曲霉毒素B1。粗蛋白用脱氧核糖核酸酶Ⅰ处理后发现可降解80.5%的黄曲霉毒素B1，但用蛋白酶K处理后降解率降至34.5%，这表明该菌对黄曲霉毒素的解毒作用可能是酶促反应。

Hormisch等（2004年）以荧蒽为唯一碳源，从煤田附近污染的土壤样品中分离到一株分支杆菌（Mycobacterium fluoranthenivorans）。研究发现，该菌既能降解荧蒽，又能降解黄曲霉毒素B1。通过进一步的试验证明其降解是生物酶解作用。

Teniola等（2005年）报道了4株菌可降解黄曲霉毒素B1。其中，红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）和分支杆菌的胞外提取物在30℃温度条件下分别与黄曲霉毒素反应4h后，降解率均高于90%，8h后基本上检测不到黄曲霉毒素残留。胞外提取物在经蛋白酶K和热处理后解毒效率大大降低，从而推断此解毒过程为酶促反应。

Alberts等（2006年）通过对红串红球菌降解黄曲霉毒素B1的机理进行研究，认为产生生物降解作用的是其分泌的胞外酶。

在国内，中国农业大学首先创建了香豆素培养基初步筛选微生物的方法。由于香豆素与黄曲霉毒素在化学结构上有相似性，假设降解香豆素的菌有可能降解黄曲霉毒素B1。此方法操作过程安全，可减少操作人员与毒素的接触，且准确性高，已申请国家发明专利。关舒（2009）、李俊霞（2008）等利用香豆素初筛，从土壤、发霉粮食和饲料、动物粪便等样品中得到199株细菌，再利用黄曲霉毒素B1作为底物进一步筛选，得到26株菌株具有降解黄曲霉毒素的活性。对其降解活性大于75%的9株菌进行形态学观察和16SrDNA鉴定，得到的9株菌分别为：橙红色粘球菌Myxococcus fulvus、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、短波单胞菌Brevundimonas sp.、克雷伯氏菌Klebsiella sp.、短状杆菌Brachybacterium sp.、霍氏肠杆菌Enterobacter hormaechei、炭疽芽孢杆菌Bacillus anthracis、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和纤维菌Cellulosimicrobium sp.。

Guan等（2008）通过试验证明，其中的橙红色粘球菌和嗜麦芽窄食单胞菌对黄曲霉毒素的作用是生物酶解作用。

王宁等（2009）对其中来源于灰叶猴粪便的橙红色粘球菌经单因素试验和正交试验得到最优培养基（CaCl₂·2H₂O为1g/L，MgSO₄·7H₂O为0.5g/L，酵母粉为为7g/L，VB12为750μg/L）和最佳发酵产酶条件（接种量20%，发酵温度为30℃，初始pH为7.5，发酵时间为50h，摇床转速160r/min），最佳发酵条件下该菌对黄曲霉毒素B1的降解率可达到78.2%。

陈晓飞等（2011）利用香豆素代替黄曲霉毒素，作为唯一碳源和能源进行初筛，共筛选出4株对黄曲霉毒素降解率较高的菌株，分别属于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、链霉菌（Streptomyces sp.）和厚壁菌（Firmicutes bacterium），对黄曲霉毒素B1的降解率最高达70%。目前国内还没有恶臭假单胞菌降解黄曲霉毒素的报道。

王会娟（2012）筛选到高产漆酶的菌株平菇P1，将黄曲霉毒素B1与平菇P1发酵液振荡混匀后，30℃下静置温育72h，黄曲霉毒素B1可被降解76.13%；延长温育时间，降解率可达91.80%。

三、小结

黄曲霉毒素是一种强致癌的天然毒素，直接威胁着动物的生产性能和人类的健康。目前，生物降解毒素的研究已取得了一定进展，研究人员对于黄曲霉毒素生物降解的研究启示我们可以通过生物酶解的方法去除毒素，并且在适宜的条件下也不会产生其他有毒的化学物质。但是对于黄曲霉毒素生物降解的研究还有许多不足之处，一般性的研究主要是侧重于降解菌株的筛选和菌株的降解能力，对于解毒酶的特性和降解的机理则缺乏深入的研究和探讨。

目前，国内外用生物降解饲料中黄曲霉毒素的应用较少，还没有关于生物酶降解饲料中黄曲霉毒素饲料添加剂的相关报道。因此需要用到分子生物学、基因工程及生物化学等手段，对解毒酶粗提液进行分离纯化，对获得的活性蛋白单一组分进行基因克隆及序列测定，并转化到载体中进行高效表达，以开发出高纯度和高活性的新型饲料添加剂，这是饲料工业新的研究发展方向。(www.daowen.com)

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