风味酸乳的制备及品质检测

武汉东湖学院生命科学与化学学院　徐　浩　沈　逸　涂　毅

我们从市售酸奶中分离得到了保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，制作了风味酸乳，然后用双缩脲法测定了蛋白质的含量，用稀释平板计数法测定了菌落总数。结果表明，接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌制作的酸奶口感好于单菌；随着培养时间的递增，乳酸菌菌落总数会先增后减，蛋白质的含量会逐渐减少。

乳制品是用牛奶经过不同的乳酸菌发酵等工艺加工而成。由乳酸菌发酵制成的酸奶中，蛋白质含量达2.8%以上，风味独特、酸甜可口、营养丰富，其中又含有活的益生菌，有利于人体肠道中有益菌群的平衡，是一种老幼皆宜的微生态制剂类保健饮品，具有很好的发展前景。乳酸菌是一类革兰氏阳性球状、球杆状和杆状细菌，最常用的酸奶发酵菌种是保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热乳酸链球菌（Streptococus thermophilus）。酸奶发酵的原理是乳酸菌能够在厌氧或兼性厌氧条件下发酵己糖产生乳酸，形成与人类生活密切相关的发酵产品。

本研究将从市售酸奶产品中分离得到保加利亚乳杆菌和嗜热乳酸链球菌，然后用不同菌种发酵鲜奶，测定产品中蛋白质和活菌含量，研究酸奶发酵的规律。

一、材料与方法

1.仪器与试剂

高压蒸汽灭菌锅（上海华线核医）、超净工作台（上海博讯）、光学显微镜（南京舜宇）、培养箱（上海新苗）、可见光分光光度计（上海尤尼柯）、离心机（德国sigma）。

原料奶粉：安婴儿脱脂奶粉，产品编号Q/MZCH 0003S。

原料酸奶：蒙牛（只含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）。

盐酸、氢氧化钠、氯化钠、酒石酸钾钠、碘化钾、硫酸铜、四氯化碳、蔗糖、溴甲酚绿、无水乙醇、碳酸钙、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰。以上试剂均为分析纯。

牛血清白蛋白、酵母膏、琼脂。以上为生化试剂。

2.实验方法

（1）乳酸菌的分离纯化

按照文献的方法配制BCG牛乳培养基、MRS培养基和脱脂乳试管培养基。

将市售酸奶充分摇匀后，用无菌生理盐水十倍稀释法稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5各种稀释度的样品液。

取0.2ml10^-2、10^-3两个稀释度的试管中原液，在BCG牛乳培养基琼脂平板上用涂布棒涂布分离，置40℃培养箱中培养48h。之后用MRS培养基进一步分离。

选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，4℃环境下培养8—24h。若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞为杆状或链球状（两种形状的菌种分别选入），革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代4—6次，最终选择出在3—6h能凝固的乳酸菌作菌种待用。

（2）接种发酵

按奶粉、蔗糖、蒸馏水10︰5︰70的比例配制奶液，108℃灭菌15min后冷却，在无菌操作台中将保加利亚乳杆菌单菌和混合菌分别接种到含奶液的锥形瓶中，40℃培养发酵，24h后观察是否产生凝乳，若有则进行后续测定。

（3）品质检测

蛋白质含量测定

把牛血清白蛋白配制成不同浓度梯度的溶液，用双缩脲法测定其536nm处的吸光值，制作工作曲线。取自制酸奶产品1ml，同法测定，求出产品的蛋白质含量。

活菌计数

制备10倍系列样品稀释液，选择3—4个适宜稀释度的样品溶液。

分别取0.2mL稀释液均匀涂布于30块计数培养基平板上，37℃恒温培养24—48h。记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units,cfu）表示。

二、结果与讨论

1.乳酸菌的分离纯化

将10^-2、10^-3 两个稀释度的酸奶稀释液涂布在BCG培养基上，24h后观察到菌落呈圆形，乳白色，直径1—3mm，分布不均匀。用牙签挑取乳白色菌落置于灭菌脱脂乳试管中培养24h，检测发现呈浓稠状态，涂片镜检为杆状和球状菌体，革兰氏染色为阳性。在MRS固体培养基中生长的菌落形态为底部略带微黄色，表面多为乳白色，边缘不整齐，表面较光滑、湿润，中间凸起。经进一步镜检分离，得到了纯的保加利亚乳杆菌。

2.接种发酵

采用分离到的保加利亚乳杆菌进行单菌发酵，并用双菌混合发酵作对比。产品形态及风味如表1所示。

表1　发酵酸乳的形态与风味(www.daowen.com)

Table1 State and flavor of fermented yogurt

（△为酸度，越多则越酸；★为甜度，越多则越甜）

原奶液中没有接种任何菌种，无任何味道变化；杆菌单菌发酵则较酸，无甜味；混合菌有奶香，有很淡的甜味，初步呈现市售酸奶的色、香、味，由于没有加入任何添加剂，所以味道不如市售酸奶。

3.品质检测

（1）蛋白质含量测定

采用双缩脲法测定536nm处的吸光度，绘制标准蛋白质溶液的工作曲线，如图1所示。吸光度y与蛋白质含量x（mg/ml）之间的关系式为y=0.04245x+0.0117，相关系数r=0.99895。

图1　标准蛋白质工作曲线

Fig.1　The working curve of standard protein

将保加利亚乳杆菌和混合双菌分别进行酸奶发酵，测定不同时间产品的蛋白质含量，结果如表2所示。

从表2中可以看出，随着发酵时间的递增，脱脂奶液中蛋白质的含量逐渐减少，因为乳酸菌的生长需要从蛋白质和多肽中获得氮源来维持它们的新陈代谢。自然环境中乳酸菌能够很好地利用栖息地中的物质生长，而乳中的乳酸菌能够利用乳糖作为碳源，但不能同化无机氮源，因此，它们必须降解蛋白质（如酪蛋白）和多肽来满足细胞合成代谢对氨基酸的需要。

同时从表2中也可以看到，混合双菌对蛋白质的消耗利用大于杆菌单菌。在市售酸奶中为了口感和香味达到比较好的水平，都采用双菌或多种菌混合发酵，因而对蛋白质的消耗更加明显，所以必须放置于4℃低温下保藏，以抑制乳酸菌的生长，使蛋白质含量维持在一定水平，保持其营养价值。

表2　不同发酵时间下的蛋白质含量

Table2　The protein content of different fermentation time

（2）活菌计数

在发酵72h后，对菌落数进行测定，其中混合菌菌落总数为1.165×10⁹cfu/ml，杆菌菌落总数为9.25×10⁸cfu/ml。酸奶的营养价值在很大程度上取决于其中的活乳酸菌含量。乳酸菌对其他有害菌的生长有较强的抑制作用。酸奶品质好坏的一个重要指标之一是活乳酸菌数多少。国家卫生标准GB16321-2003中规定，酸奶中活乳酸菌数必须达到10⁶ cfu/ml以上。

目前已知保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌之间存在共生关系。近年来有研究表明，并不是所有的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌之间都存在良好的共生关系。共生关系是否良好与每个菌株的生长动力学特异性有关，所以对于混合双菌中两种菌的菌落数量比例并不是很清楚，双菌和单菌菌落总数不好比较。

有文献报道，酸奶中乳酸菌含量随贮藏时间发生变化，在第7天前, 由于生长条件适宜，乳酸菌迅速生长和繁殖，从发酵前（1.05×10⁷cfu/ml）到发酵后（4.20×10⁹cfu/ ml）仅需2.5h，含菌数提高了400倍，第5—7天达到高峰期，含菌量达（2.45—2.80）×10¹⁰cfu/ml。第8天后，由于酸奶的糖分、蛋白质等有机物含量有限，代谢产物增多，影响了乳酸菌繁殖生长的理化环境，抑制了乳酸菌的生长，并导致部分死亡，含菌量逐渐下降，因此也保藏在4℃温度下以抑制其生长，使酸奶中乳酸菌总数维持在较高水平。

三、结论

本研究探讨了乳酸菌发酵酸奶的制作方法，使用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵的方法制作了风味酸乳，结果表明使用多菌种混合发酵对于成品酸奶的营养、口感等方面有很大的提升。

随着发酵时间的递增，酸奶中的蛋白质含量呈现下降的趋势，酸奶发酵的时间必须控制在较短范围内，同时保藏在较低温度下。乳酸菌随着酸奶中有机酸的增加，生长受到抑制，数量逐渐减少。

后续研究将优化发酵条件，探索总乳固体、菌种接入量、pH等因素对酸奶发酵的影响。

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